胡莉琴，康信聰，沈鵬原，陳田，張家銀，劉東波,3,4

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

2 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

3 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

4 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

石杉?jí)A甲 (Huperzine A，簡(jiǎn)稱Hup A) 是一種我國(guó)自主研發(fā)的高效、低毒、可逆且高選擇性抑制乙酰膽堿酯酶的石松類生物堿，常用于老年癡呆癥、記憶障礙、重癥肌無(wú)力的治療[1-2]。在老年癡呆癥的治療中，與美國(guó)FDA批準(zhǔn)的同類藥物他克林、多奈哌齊、利斯的明及加蘭他敏相比，Hup A的抗膽堿酯酶活性更高，作用持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，口服生物利用度更高，毒性作用更小[3-5]。石杉?jí)A乙(HuperzineB，簡(jiǎn)稱Hup B) 抑制活性為石杉?jí)A甲的1/10，但Hup B具有更長(zhǎng)的活性持續(xù)時(shí)間[6]。

顯著的療效與巨大的商業(yè)價(jià)值使得Hup A的價(jià)格節(jié)節(jié)攀升，純度為98%的Hup A出口價(jià)格已從2012年的200萬(wàn)元/kg增至400多萬(wàn)元/kg。雖然Hup A、Hup B在植株內(nèi)含量很低 (最高含量分別為0.090 0%、0.018 3%)，但目前Hup A、Hup B仍主要從野生蛇足石杉 (Huperzia se rrateT.) 等石松類石杉科石杉屬植物中直接提取。蛇足石杉生長(zhǎng)條件苛刻、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)[7-8]，過(guò)度開(kāi)采導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕，組織培養(yǎng)尚未成功；Hup A人工全合成步驟繁瑣、價(jià)格昂貴，無(wú)法獲得純光學(xué)活性合成物質(zhì)，Hup A至今未能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[9]，無(wú)法滿足市場(chǎng)用藥需求，制約了Hup A、Hup B的臨床發(fā)展。

自Stierle等首次從短葉紅豆杉Taxus brevifoliaN.的樹(shù)皮中分離到一種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌——安德紫杉菌Taxomyces andreanae[10]以來(lái)，內(nèi)生真菌合成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物受到了極大的關(guān)注，為解決資源短缺、產(chǎn)量極低的藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。迄今，有關(guān)蛇足石杉內(nèi)生真菌的研究已有不少報(bào)道，2005年石瑋等[11]從采自安徽青陽(yáng)的H.se rrata中分離出4株內(nèi)生真菌，分別屬于頂孢霉屬、單軸霉屬、酵母和青霉屬；韓文霞等[12-13]從浙江衢州烏巨山的H.serrate中分離出產(chǎn)Hup A的青霉菌與鐮孢菌。本實(shí)驗(yàn)室從福建南平H.serrate中分離出具有合成Hup A、Hup B能力的內(nèi)生真菌膠胞炭疽tanju (Colletotrichum gloeosporioidesP. tanju)。目前，Hup A、HupB的HPLC方法學(xué)考察主要集中于石杉科植物H.serrate[6,14]，對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的Hup A、HupB HPLC檢測(cè)方法的考察未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B的HPLC測(cè)定方法，并以此方法檢測(cè)了 tanju菌發(fā)酵過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的積累過(guò)程。Hup A、Hup B HPLC快速檢測(cè)方法的建立為后期內(nèi)生真菌膠胞炭疽合成Hup A、Hup B的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，從而有利于藥物新資源的開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛇足石杉 (采自福建南平)；內(nèi)生真菌膠胞炭疽 (本實(shí)驗(yàn)室分離)；Hup A 標(biāo)準(zhǔn)品 (Aladdin)；Hup B標(biāo)準(zhǔn)品 (上海源葉生物科技有限公司)；甲醇為色譜純，醋酸銨、氯仿均為分析純 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Mettler Toledo pH計(jì) (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

主要儀器和設(shè)備：Agilent-1260 Infinity高效液相色譜；Mettler Toledo XS205型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖肉湯 (Potato dextrose broth，PDB) 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 L。

PDB加富培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.3 g，加蒸餾水定容至1 L后調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.2.2 誘導(dǎo)子的制備

將新鮮的蛇足石杉去除根部，用自來(lái)水沖去泥土、腐葉，用超純水洗凈，吹干水分稱重，然后切碎。加入少許水將葉片打成漿汁，用8層紗布過(guò)濾，最后用超純水按1∶10的質(zhì)量體積比定容至一定體積，分裝121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，–20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵液中Hup A、Hup B提取

內(nèi)生真菌炭疽 tanju置 PDB培養(yǎng)基中活化3 d，取1 mL菌絲于PDB加富培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d使菌絲量達(dá)到最高，加入誘導(dǎo)子5 mL后繼續(xù)培養(yǎng) (空白對(duì)照：PDB+5 mL誘導(dǎo)子)。加入誘導(dǎo)子培養(yǎng)至一定時(shí)間后采用真空泵分離菌液和菌絲，將分離的100 mL菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至體積為30 mL，加等體積30 mL氯仿萃取1次，再體積減半氯仿再次萃取1次，合并濾液，揮干后加入2 mL色譜甲醇溶解，超聲10 min，混勻后過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，濾液樣品待測(cè)。

1.2.4 HPLC檢測(cè)條件

Agilent Eclipse plus-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相 0.015 mol/L 乙酸銨-甲醇溶液 (70∶30)，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。在波長(zhǎng)選擇上，Hup A在308–310 nm均有很好的紫外吸收，而Hup B在308 nm上有良好的紫外吸收，故波長(zhǎng)選用308 nm。在此色譜條件下，樣品中的Hup A、Hup B與其他峰能達(dá)到基線分離。

1.2.5 對(duì)照品制備

Hup A對(duì)照品：精密稱取Hup A對(duì)照品2.40 mg于25 mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，得濃度為0.096 mg/mL對(duì)照品溶液，再分別稀釋成 48.0、24.0、12.0、6.0、3.0、1.5 μg/mL 的對(duì)照品供試液，待測(cè)。

Hup B對(duì)照品：精密稱取 Hup B對(duì)照品2.50 mg于25 mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，得濃度為0.1 mg/mL對(duì)照品溶液，再分別稀釋成7.50、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25 μg/mL 的對(duì)照品供試液，待測(cè)。

1.2.6 儀器精密性、樣品穩(wěn)定性、檢測(cè)限(LOD)、定量限 (LOQ) 和樣品加標(biāo)回收率檢測(cè)方法

儀器精密：取制備好的Hup A和Hup B標(biāo)準(zhǔn)品，分別以進(jìn)樣量10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。樣品穩(wěn)定性、LOD、LOQ：取供試樣品1份，將樣品于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，按“1.2.4” HPLC條件測(cè)定峰面積，LOD和LOQ的測(cè)定是根據(jù)響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)曲線所得到的斜率[15]，LOD和LOQ分別表示為3.3a/S和10a/S(a表示響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S表示回歸線的斜率)。樣品加標(biāo)回收率：取已測(cè)Hup A樣品加入0.4 mL Hup A對(duì)照品溶液 (濃度16.5 μg/mL)、取Hup B樣品加入0.4 mL Hup B對(duì)照品溶液 (濃度5.5 μg/mL)，得供試品樣液，微孔濾膜濾過(guò)，得加樣回收液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，回收率計(jì)算公式如下：

1.2.7 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵特性研究

在內(nèi)生真菌tanju菌株培養(yǎng)穩(wěn)定期 (菌培養(yǎng)至第5 天) 加入誘導(dǎo)子5 mL，連續(xù)檢測(cè)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中第6–15天次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的含量，每天3個(gè)平行；同時(shí)檢測(cè)誘導(dǎo)子中Hup A、Hup B的含量。內(nèi)生真菌 tanju菌誘導(dǎo)后 Hup A/Hup B的含量=發(fā)酵液中總Hup A/Hup B含量–誘導(dǎo)子中Hup A/Hup B含量。

將從發(fā)酵液分離出的菌絲60 ℃干燥至恒重，冷卻稱重為干重，重復(fù)3次取平均值即為其生物量，菌液測(cè)定其pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察

將已制備的Hup A和Hup B對(duì)照品按“1.2.4”色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

其校準(zhǔn)圖的相關(guān)系數(shù)r大于0.998 5[16-17]，可知當(dāng)進(jìn)樣量位于 1.50?48.00 μg/mL、0.25?7.50 μg/mL之間時(shí)，Hup A、Hup B的進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2 儀器精密性、樣品穩(wěn)定性、LOD、LOQ和樣品加標(biāo)回收率結(jié)果

Hup A、Hup B標(biāo)準(zhǔn)品分別連續(xù)進(jìn)樣6次，其中Hup A標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積RSD為0.31%，Hup B標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積RSD為1.01%，結(jié)果表明儀器精密性良好。樣品按“1.2.6”測(cè)定峰面積，Hup A的峰面積RSD為1.23%；Hup B的峰面積RSD為2.40%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。同時(shí)，Hup A的檢測(cè)限和定量限分別為0.42 μg/mL、0.81 μg/mL；Hup B 的檢測(cè)限和定量限分別為0.30 μg/mL、0.62 μg/mL。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明Hup A的平均回收率為106.83%(RSD=3.34%，n=3)、Hup B的平均回收率為108.06% (RSD=3.60%，n=3)。

2.3 樣品中Hup A、Hup B檢測(cè)結(jié)果

將已制備好的樣品按“1.2.4”色譜條件重復(fù)分析3次，測(cè)得Hup A標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間22.517 min(圖1A)，Hup B的保留時(shí)間10.413 min (圖1B)，內(nèi)生真菌發(fā)酵液中 Hup A、Hup B的保留時(shí)間分別為22.513 min、10.312 min (圖1C)，空白對(duì)照中Hup A、Hup B的保留時(shí)間分別為22.430 min、10.308 min (圖1D)，結(jié)果顯示發(fā)酵液和空白對(duì)照中Hup A、Hup B的保留時(shí)間和其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算誘導(dǎo)子和發(fā)酵液提取物中Hup A、Hup B的含量，測(cè)得發(fā)酵液中 Hup A、Hup B的平均濃度分別為19.248 9 μg/mL、6.442 4 μg /mL，誘導(dǎo)子中 Hup A、Hup B平均濃度分別為5.771 0 μg/mL、2.161 0 μg/mL，因此，膠胞炭疽合成Hup A、Hup B產(chǎn)量分別為13.477 9 μg/mL、4.281 4 μg /mL。

2.4 誘導(dǎo)子作用時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量影響曲線

在前期研究中發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)穩(wěn)定期加入誘導(dǎo)子，其次生代謝產(chǎn)物Hup A、Hup B的含量更高，所以本試驗(yàn)在tanju菌生長(zhǎng)至第5天加入誘導(dǎo)子。結(jié)果如圖2所示，內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B的含量在誘導(dǎo)子加入后均有明顯提高，其含量均先增加后減少，隨后又升高繼而再繼續(xù)減少，發(fā)酵液中 Hup A含量在第 14天達(dá)到最高(12.417 0 μg/mL)，Hup B 在第 8天達(dá)到最高(4.660 3 μg/mL)。

表1 Hup A和Hup B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of Hup A and Hup B in samples

圖1 Hup A標(biāo)準(zhǔn)品 (A)、Hup B標(biāo)準(zhǔn)品 (B)、內(nèi)生真菌 tanju發(fā)酵液提取物 (C) 和誘導(dǎo)子提取物 (D)的HPLC圖Fig. 1 The HPLC chromatograms of the Hup A standard (A), the Hup B standard (B), sample extracted from endophytic fungi tanju (C) and sample extracted from elicitor (D). The standard content of Hup A is 24.0 μg/mL, and that of Hup B is 5.0 μg/mL.

圖2 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量的變化Fig. 2 Effects of Hup A and Hup B contents in fermentation broth of endophytic fungus tanju.

2.5 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵培養(yǎng)特性研究

從圖3可以看出，菌株從第1天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天生物量達(dá)到最大值，隨后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，第8天后菌株進(jìn)入衰亡期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，隨著菌絲量的迅速增加，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和胞外降解導(dǎo)致發(fā)酵液pH值由6.50降至4.69，在酸性條件下，內(nèi)生真菌tanju生長(zhǎng)狀況良好。隨后由于次生代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液 pH值回升，在菌絲生物量達(dá)到最高時(shí)，發(fā)酵液酸堿度趨于中性，進(jìn)入衰亡后期培養(yǎng)液 pH值繼續(xù)緩慢上升，Hup A、Hup B積累期間培養(yǎng)液呈弱堿性(圖 3)。

圖3 內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Fermentation curves of endophytic fungi tanju.

3 討論

本文建立了HPLC測(cè)定內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵液中Hup A、Hup B含量的方法。本課題組曾采用Agilent ZORBAX SB-C18進(jìn)行Hup A、Hup B的檢測(cè)，但受色譜柱殘余硅羥基的影響，Agilent ZORBAX SB-C18對(duì)分析物產(chǎn)生強(qiáng)烈吸附而造成色譜峰嚴(yán)重拖尾。雖然本實(shí)驗(yàn)室在流動(dòng)相乙酸銨中加入 1%–3%的三乙胺 (pH 4–5)，可減少 Hup A、Hup B和殘余硅羥基的相互作用，峰形更尖銳、對(duì)稱性更高，有效減輕了色譜峰的拖尾現(xiàn)象，但保留時(shí)間大大減少，不利于各組分的分離，且易對(duì)色譜柱造成不可逆的損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)室選用了適合生物堿分離的Agilent Eclipse plus-C18色譜柱，該色譜柱改進(jìn)了硅膠制造和鍵合技術(shù)，對(duì)于難分離的堿性化合物可獲得出色的峰形。本試驗(yàn)證明該色譜柱在分離Hup A、Hup B時(shí)，峰對(duì)稱性良好，且與其他物質(zhì)能達(dá)到很好的基線分離。

本試驗(yàn)所分離的內(nèi)生真菌 tanju在分離初期即使未誘導(dǎo)也可合成Hup A和Hup B，但隨著菌株保存時(shí)間的延長(zhǎng)、傳代次數(shù)的增加，tanju菌在未添加誘導(dǎo)子的情況下，發(fā)酵液中檢測(cè)不到 Hup A與Hup B。本課題組在內(nèi)生真菌tanju發(fā)酵的第5天 (生長(zhǎng)穩(wěn)定期) 添加誘導(dǎo)子，較生長(zhǎng)初期添加誘導(dǎo)子Hup A、Hup B含量高。這可能是由于在早期添加誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)子被用于合成初級(jí)代謝產(chǎn)物，或者生長(zhǎng)早期細(xì)胞還沒(méi)有合成太多功能酶，誘導(dǎo)子的利用率較低，而在生長(zhǎng)穩(wěn)定期添加，生物量有了一定的積累，受誘導(dǎo)子刺激后，即可合成次級(jí)代謝產(chǎn)物[18]。然而，Ballica等[19]曾提出誘導(dǎo)子在達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期之前加入效果最好，可見(jiàn)添加誘導(dǎo)子因種屬不同而有所差別。另外，誘導(dǎo)子的種類、添加時(shí)間及濃度對(duì)內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量均有影響[20-22]。

相比直接從H.serrata等石松類植物提取獲得Hup A、Hup B，能夠合成Hup A、Hup B的內(nèi)生真菌具有更大的發(fā)展?jié)摿Γ驗(yàn)閮?nèi)生真菌培養(yǎng)簡(jiǎn)單、周期短，可進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件[23]。此外，還可通過(guò)多種手段改造、提高菌種性能，例如誘變育種、深入研究Hup A合成關(guān)鍵酶、構(gòu)建Hup A高產(chǎn)工程菌[24-26]。通過(guò)內(nèi)生真菌發(fā)酵合成Hup A、Hup B是解決瀕危植物藥物開(kāi)發(fā)的有效途徑。

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