黃莉敏，張大準，王艷，張巧，梁偉，張永頂，熊祖應

1 北京大學深圳醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035

2 深圳市伯勞特生物制品有限公司，廣東 深圳 518054

膜性腎病 (Membranous nephropathy，MN)是一個病理學概念，根據(jù)病因可分為原發(fā)性膜性腎病 (Primary membranous nephropathy，pMN) 和繼發(fā)于全身其他病因的繼發(fā)性膜性腎病 (Secondary membranous nephropathy，sMN)。兩者臨床表現(xiàn)相似，僅從臨床表現(xiàn)不能進行鑒別，但兩者治療方案差異巨大，如何鑒別pMN和sMN一直困擾著國內(nèi)外腎臟病專家[1-2]。2009年，Beck等[3]在pMN患者血清中檢測出抗 M型磷脂酶 A2受體(Phospholipase A2 receptor，PLA2R)抗體，抗體陽性率可達約70%；而健康人、sMN病人及其他腎病患者血清抗體均陰性，提示抗PLA2R抗體可能是pMN特異性標志物。而國內(nèi)外相關研究也相繼證實抗PLA2R抗體在膜性腎病中的作用[4]。

目前市場上僅有歐蒙公司能生產(chǎn)該 ELISA試劑盒，本研究通過自主研發(fā)，自制了 PLA2R抗體定量檢測 ELISA試劑盒，并對試劑盒性能進行了評價。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 pMN組

北京大學深圳醫(yī)院腎內(nèi)科2010年5月至2016年2月住院患者，經(jīng)腎穿刺活檢病理組織檢查，通過光鏡、免疫熒光、電鏡確診為 MN；并通過臨床資料，結合實驗室檢查，排除腫瘤、藥物、感染及其他自身免疫病等引起的繼發(fā)性膜性腎病。于腎穿刺當日清晨留取患者血清標本，符合標準的276例pMN患者入組。

1.1.2 非pMN組

隨機選取同期診斷為其他腎臟病及健康體檢者，共122例入組。包括繼發(fā)性膜性腎病 (sMN)12例，腎功能不全9例，糖尿病患者8例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡6例，健康體檢者87名 (年齡在20–70歲之間)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

所有入組患者于清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血，于3 000 r/min、4 ℃離心10 min。分離血清，并分裝于–80 ℃冰箱待用。

1.2.2 抗原及校準品制備

抗原為HEK293細胞表達的重組PLA2R全長蛋白 (由美國 SHENZHEN BLOT BIOTECHWISCONSIN，LLC公司提供，HEK293細胞表達)。校準品通過德國歐蒙公司 (E150522BD) 檢測膜性腎病患者血清，選取抗體滴度大于1 500 RU/mL的陽性血清，將陽性血清混合后以陰性血清進行不同比例稀釋作候選校準品原料血清，再通過注冊試劑盒重復檢測候選校準品血清3次，選擇與注冊試劑盒校準品OD值無差異 (P>0.05) 的校準品候選血清。入選校準品血清以校準品稀釋液稀釋 101倍即得自制試劑盒校準品 (市售試劑盒校準品滴度2、20、100、500、1 500 RU/mL)。

1.2.3 自制ELISA試劑盒

用0.05 mol/L CB緩沖液稀釋重組PLA2R抗原至1 μg/mL，加入酶標板，每孔100 μL，于4 ℃包被過夜。TBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。每孔加入1%的 BSA，150 μL/孔，室溫 (18–26 ℃) 封閉30 min。將酶標板拍干，置于室溫 (18–26 ℃)、濕度<15%條件下干燥2–4 h，封裝并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 自制ELISA試劑盒檢測血清抗體滴度

待檢樣本用 Tris+1% BSA稀釋液按 1∶101稀釋 (Sigma公司)，取包被好的酶標板條，室溫平衡之后，加入稀釋好的樣本和校準品以及對照品，每孔100 μL，室溫溫育30 min；然后洗滌3次(TECAN洗板機)，加入1∶6 000稀釋好的HRP標記兔抗人IgG (Sigma公司)，每孔100 μL，室溫溫育30 min；洗滌3次，加入底物TMB，每孔100 μL，室溫避光反應30 min；加入0.5 mol/L的H2SO4，每孔100 μL終止反應。用酶標儀(TECAN NanoQuant) 測定450 nm和620–650 nm任一波長處的吸光度值，以450 nm波長處的吸光度值減去620–650 nm 波長處的吸光度值記為各孔的OD值。然后以校準品的濃度值 2、20、100、500、1 500 RU/mL作為x軸，各校準品對應的OD值作y軸，進行曲線回歸擬合，根據(jù)擬合的標準曲線方程計算出各待測樣本的濃度。

1.2.5 注冊試劑盒測血清抗體滴度

該檢測試劑盒購自德國歐蒙公司(E150522BD)，實驗操作按試劑盒內(nèi)說明書進行。并根據(jù)說明書將血清抗體滴度<14 RU/mL記為陰性，將抗體滴度>20 RU/mL記為陽性。若抗體滴度介于 14–20 RU/mL則為疑似陽性，疑似陽性患者選取同期血清進行多次檢測，>20 RU/mL記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析均用SPSS 19.0，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。

1.3.1 準確度

用試劑盒內(nèi)陽性對照直接進行檢測，重復測量 3次后，其平均值記作，根據(jù)公式：測量偏差=(–理論值)/理論值×100%，結果相對偏差在±15%區(qū)間內(nèi)。

1.3.2 檢測限

用樣本稀釋液作為樣本進行檢測，重復測定20次，得出20次測量結果的吸光度值 (A值)，計算其平均值 () 和標準差 (s)，得出+2s所對應A值，根據(jù)試劑盒所用校準品校準曲線方程，將+2s所對應A值代入上述方程中，求出對應濃度值，即為檢測限，其結果不高于2 RU/mL。其中自制試劑盒記為A1，市售試劑盒記為A2。

1.3.3 測量系統(tǒng)線性范圍

將接近線性范圍上限的校準品用樣本稀釋液倍比稀釋為5種濃度，其中低值樣本需接近線性范圍下限。按試劑盒說明書進行操作，將每一濃度樣本重復檢測2次，計算其濃度平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數(shù)R2，結果線性范圍2–500 RU/mL，線性相關系數(shù)R2值不低于0.99。

1.3.4 重復性

用2個濃度水平樣本各重復檢測10次，計算10次測量濃度結果平均值和標準差s，根據(jù)如下公式 (1) 得出變異系數(shù) CV，結果變異系數(shù)(CV) 不高于 15%。其中自制試劑盒記為 CV1，市售試劑盒記為CV2。

式中，CV：變異系數(shù)；s：10次測量結果標準差；：10次測量結果平均值。

1.3.5 批間差

用3個批號試劑盒分別檢測同一份樣本，各重復10次，計算30次測量濃度值平均值和標準差s，根據(jù)公式 (2) 得出變異系數(shù)CV，結果變異系數(shù) (CV) 不高于15%。其中自制試劑盒記為CV1，市售試劑盒記為CV2。

1.3.6 穩(wěn)定性檢測

朋友是個電影迷，卻從來只喜歡看外國電影。每周六晚，中央臺的“佳片有約”，他雷打不動地看了很多年。為此，他還培養(yǎng)出了女兒，從小一直跟他看電影，也成了一個電影迷。然而，這一兩年，他不看了，明明知道有好電影，明明自己也有閑時間，卻無論如何也提不起興趣。有時候，勉勉強強看半截，就呼呼地睡著了。過后，又捶胸頓足，直呼自己“老了，老了”。

試劑盒在37 ℃恒溫箱放置6 d后，2–8 ℃貯存365 d后，取試劑盒檢測準確度、檢測限、線性范圍、重復性，應符合以上1.3.1–1.3.5要求。

2 結果

2.1 自制試劑盒性能評價結果

自制試劑盒測量偏差如表 1所示，市售試劑盒測量偏差如表2所示，測量偏差均在±15%區(qū)間內(nèi)。兩組測量偏差比較，P>0.05，不認為兩組試劑盒的測量偏差存在統(tǒng)計學差異。

檢測限評估結果見表 3及表 4，試劑盒檢測限均不高于2 RU/mL。

自制試劑盒與市售試劑盒線性范圍2–500 RU/mL，線性相關系數(shù)R2值均不低于0.99，如圖1所示。

對兩種試劑盒進行重復性檢測，自制試劑盒在100 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV1a=5.98%，在500 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV1b=4.27%。市售試劑盒在 100 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV2a=3.85%，在500 RU/mL時的批內(nèi)變異系數(shù)為CV2b=1.31%。

表1 三個不同批次自制試劑盒準確度檢驗Table 1 A test about accuracy of 3 different batches homemade kits

表2 三個不同批次市售試劑盒準確度檢驗Table 2 A test about accuracy of 3 different batches commercial kits

表3 三個不同批次自制試劑盒檢測限檢驗Table 3 A test about detectability of 3 different batches homemade kits

表4 三個不同批次市售試劑盒檢測限檢驗Table 4 A test about detectability of 3 different batches commercial kits

圖1 試劑盒線性評估Fig. 1 Liner assessment for ELISA kit. The figture of “LOT:150727, LOT:150803, LOT:150914” represent liner assessment for homomade ELISA kits, while the “E160821AD, E161010BH, E160204AH” are liner assessment for commercial ELISA kits.

檢測自制試劑盒批間差，得出變異系數(shù)CV1=7.95%，市售試劑盒批間差CV2=4.39%。兩種試劑盒3個批間差均在15%以內(nèi)。

試劑盒分別在37 ℃恒溫箱放置6 d后，4 ℃貯存365 d后，取試劑盒檢測準確度、檢測限、線性范圍、重復性。結果見表5，試劑盒在37 ℃恒溫箱放置6 d，2–8 ℃放置365 d后，試劑盒檢測準確度、檢測限、線性范圍、重復性均符合要求。

2.2 與國外同類試劑盒對比

用EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA試劑盒和自制試劑盒同時測定 276份 pMN患者血清和122份非pMN組血清，檢測結果如表6所示。歐蒙試劑盒檢測pMN患者血清敏感度為51.81%，特性度為 100%；自制試劑盒檢測敏感度為50.36%，特異度為 100%。自制試劑盒與市售商品化試劑盒比較，陽性符合率 97.2%，陰性符合率為100%，總體符合率有98.9%，兩種試劑盒的差異不顯著 (P=0.583，P>0.05）。

2.3 血清抗PLA2R抗體陽性組與陰性組基本資料與實驗室數(shù)據(jù)比較

2010–2016年在我科住院并行腎穿刺活檢病理和臨床診斷，共納入符合標準的pMN患者276例，以自制試劑盒測量抗體滴度，其中抗PLA2R抗體陽性患者139例，陰性患者137例，pMN患者血清抗 PLA2R抗體陽性率為 50.36%。通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)陰性組與陽性組患者血清肌酐無統(tǒng)計學差異，但陽性組患者年齡、尿蛋白定量高于陰性組患者，陽性組患者血白蛋白低于陰性組(P<0.05)(表7)。進一步分析抗PLA2R抗體滴度分別與尿蛋白、血白蛋白的相關性，通過線性回歸，得到如圖2A、2B所示散點圖，發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體滴度與尿蛋白呈正相關，與血白蛋白呈負相關。

3 討論

有效鑒別pMN與sMN對于疾病治療具有重要指導意義[5-6]。臨床上，當病理診斷是MN時，如果能排除各種繼發(fā)性病因，則可作出 pMN診斷。導致MN的繼發(fā)因素常常復雜多變，如某些腫瘤繼發(fā)MN，有時甚至在MN發(fā)生后數(shù)月至數(shù)年后才表現(xiàn)出來，這給臨床排除繼發(fā)病因帶來較多困難；再如膜性腎病合并乙型肝炎病毒感染與乙型肝炎病毒引起sMN鑒別，很難通過病理或其他實驗室檢查得以鑒別[7-9]。鑒別pMN和sMN的特異性抗 PLA2R抗體的出現(xiàn)無疑為臨床醫(yī)生帶來新希望。研究發(fā)現(xiàn)，超過70% pMN患者血清PLA2R抗體陽性，而 sMN患者則該抗體很少陽性；且血清抗 PLA2R抗體滴度變化先于尿蛋白變化，與病情呈平行關系，可指導臨床調(diào)整治療方案[10-14]。

表5 自制試劑盒在不同溫度放置不同時間后的穩(wěn)定性評估Table 5 Homemade kits stability assessment

表6 自制試劑盒與注冊試劑盒檢測結果Table 6 Comparison of the homemade kit and commercial kit

本課題組研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性膜性腎病患者中，血清抗體水平與蛋白尿水平呈正相關，與血清白蛋白水平呈負相關，血清抗PLA2R抗體的檢測有利于輔助病情的診斷與疾病嚴重情況的預測。本課題組自制 PLA2R抗體試劑盒可定量檢測患者血清抗PLA2R抗體，進而鑒別pMN和sMN，該試劑盒具有準確、快捷的特性，為確診pMN提供證據(jù)。同時可監(jiān)測病人血清PLA2R抗體滴度水平，評估患者病情活動性，從而調(diào)整治療方案。

表7 血清抗PLA2R抗體陽性組與陰性組基本資料Table 7 The baseline data of positive group and negative group

圖2 血清抗PLA2R抗體與24 h蛋白尿 (A) 和血清白蛋白 (B) 的關系Fig. 2 Relationship between serum anti-PLA2R antibody and 24 h proteinuria (A), serum albumin (B).

評估該試劑盒基本性能發(fā)現(xiàn)，自制試劑盒診斷檢測pMN敏感性50.36%，特異性100%，在4 ℃保存12個月，批間和批內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足臨床需要。比較本試劑盒與目前市面上唯一注冊產(chǎn)品EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA試劑盒符合率差異無統(tǒng)計學意義。但由于市售試劑盒購買受條件限制，未進行兩個試劑盒的穩(wěn)定性比較，需進一步完善。

由于抗PLA2R抗體IgG無國際約定參考測量程序和校準品，因此我們用適當校準等級傳遞方案，將校準品溯源至EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的Anti-PLA2R ELISA(IgG)檢測方法。雖然檢測臨床樣本時有 4份血清樣本出現(xiàn)差異，但整體符合率高度一致，部分差異原因可能系兩種試劑盒所選抗原片段部分不同所致。

綜上所述，依據(jù)自制試劑盒檢測病人抗PLA2R抗體滴度水平，不僅可區(qū)別pMN和sMN，還可預測患者病變活動性，為提高pMN診斷準確率，提高治愈率創(chuàng)造條件[15-16]。本試劑盒符合行業(yè)內(nèi)相關標準，與注冊試劑盒比對結果高度一致，差異無顯著意義，能滿足臨床應用需要。同時，自制試劑盒操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定，填補了國內(nèi)空白，為MN患者提供了一種有效、可靠的檢測方法。本研究也將進行更大樣本量的驗證，尋求第三方驗證，以及臨床前瞻性研究，以進一步完善自制試劑盒的性能。

[1]Song DX, Wang WT, Lin L, et al. Clinical significance of autoantibodies against phospholipase A2 receptor in adult patients with idiopathic membranous nephropathy. Chin J Pract Internal Med,2015, 35(5): 414–418 (in Chinese).宋東旭, 王武濤, 林鷺, 等. 成人特發(fā)性膜性腎病血清抗M型磷脂酶A2受體抗體臨床意義研究. 中國實用內(nèi)科雜志, 2015, 35(5): 414–418.

[2]Xie LJ, Liao YH. The molecular pathogenesis of idiopathic membranous nephropathy. Chin J Kidney Dis Invest (Electronic Ed), 2015, 4(6): 33–39 (in Chinese).謝麗君, 廖蘊華. 特發(fā)性膜性腎病的分子發(fā)病機制. 中華腎病研究電子雜志, 2015, 4(6): 33–39.

[3]Beck LH Jr, Bonegio RGB, Lambeau G, et al. M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy. N Engl J Med,2009, 361(1): 11–21.

[4]Wang Y, Wang Q, Zheng AP, et al. Diagnostic value of anti-phospholipase A2 receptor antibody in atypical membranous nephropathy. Chin J Pract Int Med, 2016, 36(11): 975–978 (in Chinese).王艷, 王琪, 鄭愛萍, 等. 抗M型磷脂酶A2受體抗體診斷成人不典型膜性腎病價值研究. 中國實用內(nèi)科雜志, 2016, 36(11): 975–978.

[5]VanBeek C, Haas M. Anti-PLA2R-associated membranous nephropathy: a review with emphasis on diagnostic testing methods. Clin Nephrol, 2015,84(1): 1–9.

[6]Xu X, Wang GB, Chen N, et al. Long-Term exposure to air pollution and increased risk of membranous nephropathy in China.J Am Soc Nephrol, 2016,27(12): 3739–3746.

[7]Ronco P, Debiec H. Pathophysiological advances in membranous nephropathy: time for a shift in patient's care.Lancet, 2015, 385(9981): 1983–1992.

[8]Segarra-Medrano A, Jatem-Escalante E, Quiles-Pérez MT, et al. Prevalence, diagnostic value and clinical characteristics associated with the presence of circulating levels and renal deposits of antibodies against the M-type phospholipase A2 receptor in idiopathic membranous nephropathy. Nefrologia,2014, 34(3): 353–359.

[9]Timmermans SAMEG, Damoiseaux JGMC,Heerings-Rewinkel PTJ, et al. Evaluation of anti-PLA2R1 as measured by a novel ELISA in patients with idiopathic membranous nephropathy: a cohort study. Am J Clin Pathol, 2014, 142(1): 29–34.

[10]Beck LH Jr, Salant DJ. Membranous nephropathy:from models to man. J Clin Invest, 2014, 124(6):2307–2314.

[11]Francis JM, Beck LH Jr, Salant DJ. Membranous nephropathy: a journey from bench to bedside. Am J Kidney Dis, 2016, 68(1): 138–147.

[12]Hill PA, McRae JL, Dwyer KM. PLA2R and membranous nephropathy: A 3 years prospective Australian study. Nephrology (Carlton), 2016, 21(5):397–403.

[13]Hoxha E, Harendza S, Pinnschmidt HO, et al.Spontaneous remission of proteinuria is a frequent event in phospholipase A2 receptor antibody-negative patients with membranous nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 2015, 30(11): 1862–1869.

[14]Kanigicherla D, Gummadova J, McKenzie EA, et al.Anti-PLA2R antibodies measured by ELISA predict long-term outcome in a prevalent population of patients with idiopathic membranous nephropathy.Kidney Int, 2013, 83(5): 940–948.

[15]Liu YP, Li C, Ma CQ, et al. Serum anti-PLA2R antibody as a diagnostic biomarker of idiopathic membranous nephropathy: the optimal cut-off value for Chinese patients. Clin Chim Acta, 2017, 476:9–14.

[16]Beck LH Jr. PLA2R and THSD7A: Disparate paths to the same disease? J Am Soc Nephrol, 2017, 28(9):2579–2589.