熊小倩，諶 雪，高夢祥

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025）

0 引言

紅曲菌也叫紅曲霉[1]，為真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬，在我國已經(jīng)有1 000多年的歷史，紅曲米是由紅曲菌接種在大米上的發(fā)酵產(chǎn)品。紅曲菌發(fā)酵能產(chǎn)生對人體有益的多種代謝產(chǎn)物，如麥角甾醇能促進(jìn)肌體對Ca，P的吸收，利于骨骼的生長[2-3]；γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA） 具有降低血壓、鎮(zhèn)靜安神、促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶力等功能[4]。其中，洛伐他汀能抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成，具有降脂的功效[5]。紅曲色素作為一種天然的食品著色劑，具有抗癌、降血糖、降血脂等多種生理活性，也是我國近年來增長速度最快的天然食用色素，在食品、化妝品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。

蕎麥?zhǔn)寝た剖w麥屬作物，富含高質(zhì)量蛋白質(zhì)，賴氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較其他谷物豐富，也富含黃酮類、植物甾醇、肌醇等功能成分[8]，其中，黃酮類化合物具有降血糖和血脂、抗癌防癌、抗氧化、清除自由基、類雌激素等生理功能，已成為蕎麥研究的又一熱點(diǎn)[9]。

試驗(yàn)利用蕎麥的營養(yǎng)成分，同時(shí)發(fā)揮紅曲菌的功能，制備出兼?zhèn)涠吖δ艿漠a(chǎn)品為目的，研究發(fā)酵溫度對固態(tài)發(fā)酵紅曲蕎麥品質(zhì)的影響，測定紅曲色素的產(chǎn)量和黃酮含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紫色紅曲菌（Monascus pupureus），長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1） 察氏酵母提取粉瓊脂培養(yǎng)基（CYA）。硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，酵母浸膏5 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

（2）蕎麥培養(yǎng)基。根據(jù)發(fā)酵條件加入20 g蕎麥和9 mL去離子水，于121℃下高溫高壓滅菌30 min，冷卻。

1.1.3 主要藥品與試劑

乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯乙酸，以上均為分析純；甜蕎麥、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、酵母浸膏、蔗糖、瓊脂。

1.1.4 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

分析天平、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、紫外可見分光光度計(jì)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、粉碎機(jī)、超聲波清洗機(jī)、顯微鏡等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲蕎麥的發(fā)酵制備

（1）紅曲菌的培養(yǎng)。超凈工作臺紫外殺菌30 min，接種環(huán)先高溫高壓滅菌；采用70%左右酒精進(jìn)行手部殺菌；用滅菌后的鐵環(huán)刮取適量紅曲菌涂抹于CYA培養(yǎng)基上，接種環(huán)、紅曲菌種瓶口和需要接種的培養(yǎng)基瓶瓶口在使用前和使用后都需要在酒精燈灼燒滅菌。接種后，將培養(yǎng)基放置在恒溫培養(yǎng)箱中，于30℃下培養(yǎng)7 d。

（2） 孢子懸液的制備。超凈工作臺紫外殺菌30min，有玻璃珠的錐形瓶、過濾紙、漏斗、裝有去離子水的錐形瓶等進(jìn)行高溫高壓滅菌；采用70%左右酒精消毒，無菌條件下，將已長好的菌株用無菌水沖洗，刮下來，過濾后轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的100 mL錐形瓶中，振蕩并搖勻。無菌條件下，取50μL孢子液于2 mL離心管；從離心管中取10μL，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下數(shù)孢子，平行數(shù)3組。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)。稱取20 g蕎麥于錐形瓶中，加入9 mL蒸餾水，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌30 min，取出冷卻；在超凈工作臺進(jìn)行，無菌操作，將1.2 mL孢子液即4.8×107個(gè)孢子接種到蕎麥培養(yǎng)基中，振蕩，分別置于不同溫度（26，28，30，32，34℃）條件下恒溫培養(yǎng)12 d；分別測定時(shí)間為2，4，6，8，10，12 d的發(fā)酵樣品中色價(jià)、生物量和黃酮含量，平行做3組。

1.2.2 生物量的測定

將紅曲蕎麥烘干后，取1.0 g干燥培養(yǎng)物，適當(dāng)粉碎后，取紅曲蕎麥粉0.2 g于50 mL離心管中，加入5%三氯乙酸25 mL，于80℃水浴條件下加熱25 min，期間不斷攪拌，冰水浴冷卻，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min于4℃條件下離心15 min。以未發(fā)酵的固態(tài)培養(yǎng)基作空白對照。

在波長260 nm處測定提取液的吸光度，由所測OD值對照純菌體與核酸紫外吸收曲線關(guān)系，換算成菌體生物量[10]；其方程為Y=5.882X+0.041 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，其擬合效果較好，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

1.2.3 總黃酮的測定

取2 g紅曲蕎麥，烘干后適當(dāng)粉碎，將紅曲蕎麥粉和70%乙醇以料液比1∶40進(jìn)行超聲波萃取。超聲清洗機(jī)在50℃，100%功率條件下超聲清洗40 min，過濾后棄去初濾液。取1 mL濾液置于25 mL容量瓶，加入30%乙醇12.5 mL，再加入質(zhì)量濃度48 g/L亞硝酸鈉0.7 mL，搖勻，靜置5 min；再加入質(zhì)量濃度91 g/L硝酸鋁0.7 mL，搖勻，靜置6 min，最后加濃度1 mol/L氫氧化鈉5 mL，定容至25 mL，搖勻，靜置10 min。以未加待測液的溶液作對照，采用721型紫外分光光度計(jì)于波長510 nm處測定OD值，可得到以蘆丁為標(biāo)樣的總黃酮含量[11]。

繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，準(zhǔn)確稱取0.013 2 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶溶解，30%乙醇定容至50 mL。分別吸取1，2，4，6，8 mL的0.263 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加入30%乙醇12.5 mL，加入48 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL，5 min后再加入91 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，6 min后，加入濃度1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，定容放置10 min，以未加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品為空白，于波長510 nm處測定其吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)、吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。其方程為Y=4.441 1X-0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，其擬合效果較好，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。試驗(yàn)測得原始蕎麥吸光度為0.069，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得原始蕎麥中總黃酮含量為3.04±0.15 mg/g。

1.2.4 色價(jià)的測定

取紅曲霉三角瓶培養(yǎng)的紅曲蕎麥2 g，干燥后適當(dāng)粉碎，將紅曲蕎麥粉和75%乙醇以料液比1∶6置于50 mL離心管內(nèi)，在60℃恒溫水浴鍋加熱浸提1 h，不斷攪拌，冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速1 300 r/min離心5 min，取上清液稀釋一定倍數(shù)，根據(jù)顏色適當(dāng)稀釋，采用紫外分光光度計(jì)測定波長410，465，500 nm處的吸光度，再乘以稀釋倍數(shù)，即得到黃、橙、紅色素色價(jià)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中溫度對紅曲生物量的影響

發(fā)酵過程中溫度對紅曲生物量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中溫度對紅曲生物量的影響

從圖1可以看出，在發(fā)酵的前6 d，生物量隨著發(fā)酵溫度的升高而增大；6 d之后，30℃條件下生長量增長最快。到發(fā)酵結(jié)束的第12天時(shí)，生物量從高到低對應(yīng)的發(fā)酵溫度為30，32，28，34，26℃，即呈現(xiàn)出以30℃為峰值的拋物線規(guī)律。這一規(guī)律與溫度影響微生物生長的普遍規(guī)律一致。這是由于生長代謝和繁殖都有酶的參加。根據(jù)酶促反應(yīng)的動力學(xué)來看，溫度升高，反應(yīng)速度加快，呼吸強(qiáng)度增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長繁殖加快。但隨著溫度的上升，酶失活的速度也越快，使衰老提前、發(fā)酵周期縮短，對發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。

2.2 發(fā)酵過程中溫度對紅曲菌產(chǎn)色素的影響

紅曲菌在以蕎麥為基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵過程中，對溫度紅曲菌代謝生產(chǎn)黃、橙、紅色素的影響。

發(fā)酵過程中溫度對紅曲黃色素的影響見圖2，發(fā)酵過程中溫度對紅曲橙色素的影響見圖3，發(fā)酵過程中溫度對紅曲紅色素的影響圖4。

圖2 發(fā)酵過程中溫度對紅曲黃色素的影響

圖3 發(fā)酵過程中溫度對紅曲橙色素的影響

圖4 發(fā)酵過程中溫度對紅曲紅色素的影響

由圖2～圖4可知，黃、橙、紅色素的變化趨勢一致，都呈現(xiàn)出隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)量逐漸升高。而且表現(xiàn)出發(fā)酵4 d后產(chǎn)生色素，3種色素的色價(jià)在30℃條件下都增長最快。結(jié)合生物量隨溫度的變化規(guī)律，發(fā)酵溫度的控制策略采取在發(fā)酵的0～4 d于34℃下培養(yǎng)，發(fā)酵4～12 d進(jìn)行30℃的培養(yǎng)。

2.3 發(fā)酵過程中溫度對蕎麥基質(zhì)中黃酮含量的影響

發(fā)酵過程中溫度對蕎麥基質(zhì)中黃酮含量的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵過程中溫度對蕎麥基質(zhì)中黃酮含量的影響

由圖5可知，蕎麥基質(zhì)的黃酮含量總體變化不顯著。在各溫度下均呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，發(fā)酵后期黃酮含量略有下降。可能是紅曲菌以蕎麥中包括黃酮在內(nèi)的其他成分為養(yǎng)分所導(dǎo)致。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以蕎麥為紅曲菌的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，以紅曲色素為試驗(yàn)指標(biāo)，探討了發(fā)酵溫度對紅曲蕎麥中紅曲色素及總黃酮類物質(zhì)的影響規(guī)律，為開發(fā)具有紅曲色素活性功能的蕎麥提供了一條新思路。