李菲 黃庶識(shí) 胡文進(jìn) 李喆 黃媛林 王巧貞 潘信利

摘 要：紅樹(shù)植物內(nèi)生菌在紅樹(shù)共生體的物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞和健康維護(hù)等方面起著重要作用。為探究紅樹(shù)植物內(nèi)生菌的多樣性，進(jìn)一步揭示內(nèi)生菌在紅樹(shù)共生體的功能多樣性提供菌種資源，該研究選擇6種分離培養(yǎng)基和采用傳統(tǒng)稀釋涂布法對(duì)從廣西北海灘涂上采集的桐花樹(shù)組織和根際土壤樣品進(jìn)行分離，對(duì)獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，并通過(guò)體外溶栓實(shí)驗(yàn)篩選出具有抗血栓活性的菌株。結(jié)果表明：（1）基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，從桐花樹(shù)組織和根際土壤中共獲得125株細(xì)菌;分布于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）3個(gè)門(mén)27個(gè)科39個(gè)屬74個(gè)種中，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，菌株數(shù)量占13.5%。（2）抗血栓活性實(shí)驗(yàn)表明，初篩獲得18株具有抗血栓活性細(xì)菌，總陽(yáng)性率為24.32%;將初篩有活性的菌株進(jìn)行復(fù)篩和重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其活性，結(jié)果復(fù)篩出3株細(xì)菌B1850、B1989和B2632具有很強(qiáng)抗血栓活性。綜上所述，廣西北海灘涂上紅樹(shù)植物桐花樹(shù)中存在豐富的可培養(yǎng)細(xì)菌資源，具有從中挖掘新的纖溶酶和開(kāi)發(fā)溶血栓藥物的潛力。

關(guān)鍵詞：桐花樹(shù)，內(nèi)生細(xì)菌，根際細(xì)菌，多樣性，抗血栓活性

血栓性疾病是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，常表現(xiàn)為心絞痛、心肌梗死、腦栓塞和腦梗死等，多以中老年人為主要發(fā)病群體，現(xiàn)發(fā)病人群逐漸趨于年輕化，且發(fā)病率與死亡率在不斷上升（喬德水等，2009;Jremo et al.，2013）。血栓性疾病的起因主要是血管腔中形成血栓使其變得狹窄或閉塞，導(dǎo)致主要器官缺血或梗死。而血栓是人體內(nèi)血液組成成分在血管或心臟內(nèi)形成的凝塊，可脫落凝塊隨血液流至遠(yuǎn)端，從而堵塞血管腔（Sun et al.，2008）。目前臨床上主要有三大類(lèi)治療血栓性疾病的藥物，即抗血小板類(lèi)、抗凝血類(lèi)和溶血栓藥物。傳統(tǒng)的溶血栓藥物在臨床上雖具有確切的療效和良好的安全性，但其存在的半衰期短、纖維蛋白特異性低和價(jià)格貴等缺點(diǎn)也不容忽視（翁郁華等，2010）。因此，尋找能解決上述問(wèn)題的溶血栓藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，海洋微生物是新型纖溶酶的重要來(lái)源之一。Lakshmi et al.（2013）從海洋沙雷菌（Serratia sp. RSPB11）分離到一種具有纖維蛋白水解活性和高熱穩(wěn)定的堿性金屬蛋白酶。李占強(qiáng)等（2009）從南海沉積物中分離到的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus B5815），其纖溶酶活性好且產(chǎn)酶量高。Huang et al.（2013）從海洋枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis HAS-3）分離到一種纖維蛋白水解酶。劉晨光等（2001）分離到一株海洋假單胞菌（Pseudomonas sp.）可產(chǎn)生較強(qiáng)的直接溶解纖維蛋白和具有抗血栓活性的堿性蛋白酶MPAP。這些為從海洋微生物來(lái)源尋找抗血栓的藥物提供了很好的依據(jù)。桐花樹(shù)系紅樹(shù)林中廣布種之一，廣泛分布于亞洲至大洋洲熱帶海岸，在我國(guó)的廣東、廣西、福建和海南等省（區(qū)）均有分布（繆紳裕等，2007）。我國(guó)的桐花樹(shù)由于受到常年全日潮水的浸淹，使之生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育、生物量分配、激素水平和相關(guān)酶系等方面的生理生態(tài)性質(zhì)表現(xiàn)出梯度性反應(yīng)（何斌源等，2007），其內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與之協(xié)同進(jìn)化。植物體為其提供生長(zhǎng)所必需的能量和營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，內(nèi)生菌又會(huì)通過(guò)自身的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)植物體產(chǎn)生響應(yīng)（文才藝等，2004）。本研究以廣西北海灘涂的桐花樹(shù)中分離、培養(yǎng)和鑒定出的植物內(nèi)生和根際細(xì)菌為樣本，旨在篩選出具有高效抗血栓活性的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本來(lái)源 桐花樹(shù)于2018年8月在廣西北海灘涂（108°50′42″ E、 21°55′25″ N）采集。樣品裝于密封袋，4 ℃低溫保藏帶回實(shí)驗(yàn)室，盡快完成前處理和分離工作。

1.1.2 羊血實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)菌脫纖維羊血（初篩羊血）和抗凝羊血（復(fù)篩羊血），均購(gòu)買(mǎi)于南寧茂接微生物科技有限公司。陽(yáng)性對(duì)照藥物：血塞通片（云南維和藥業(yè)股份有限公司），購(gòu)買(mǎi)于一心藥業(yè)。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基：AGG、M5、P7、M10、M4和P3，詳情信息見(jiàn)表1。

1.2 菌株的分離純化

1.2.1 樣品預(yù)處理 參照李菲等（2018）預(yù)處理方法，代表性地選擇桐花樹(shù)各組織進(jìn)行細(xì)菌的分離實(shí)驗(yàn)。首先，用5%次氯酸鈉溶液浸泡3～5 min，用無(wú)菌水沖洗多次;其次，用0.2%吐溫20溶液浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗多次;最后，用75%的酒精溶液浸泡5 min，用無(wú)菌水沖洗多次。消毒后的組織樣品，分別用無(wú)菌手術(shù)刀進(jìn)行切碎;取約1 g的樣品進(jìn)行充分研磨，加入9 mL無(wú)菌水與樣品混勻，即為初始的組織懸液，再依次稀釋到103和104的組織懸液，待用。

桐花樹(shù)根際樣品的收集，輕輕刮下根須表面附著的土壤，平鋪于無(wú)菌平皿中，經(jīng)65 ℃熱風(fēng)干燥30 min。稱(chēng)取2.0 g樣品裝于20 mL無(wú)菌水中搖勻;制成102和103稀釋度的樣液，待涂布處理。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化 取200 μL梯度稀釋的樣液接種于6種復(fù)合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)數(shù)周，并及時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)情況，挑取肉眼可見(jiàn)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和相同菌落數(shù)，以30%（V/V）甘油-ISP2混合液作為保護(hù)劑，將純化好的菌株制成凍存管保藏于-70 ℃。

1.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Chelex-100樹(shù)脂（周雙清等，2010）快速提取細(xì)菌的DNA作為PCR模板，并根據(jù)Walsh（1991）的方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為27F和1522R，參照李菲等（2018）的方法設(shè)定PCR反應(yīng)條件。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖-TAE凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzTaxon服務(wù)器進(jìn)行在線(xiàn)比對(duì)（Kim et al.，2009）;以同源性最高菌株的有效序列作為參比對(duì)象，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支置信值檢測(cè)設(shè)為Boostrap1 000次，對(duì)各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析（Li et al.，2017）。

1.4 細(xì)菌對(duì)抗血栓活性的篩選

1.4.1羊血培養(yǎng)基制備 以改良ISP2固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至55 ℃，添加10%脫纖維無(wú)菌羊血，搖勻后倒入無(wú)菌平皿中，待平皿靜置冷卻2 h后，待用。

1.4.2 初篩 首先將排重后的74株細(xì)菌，分別接種至ISP2固體培養(yǎng)基上，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期的細(xì)菌劃線(xiàn)至羊血培養(yǎng)基上，每板劃4株細(xì)菌，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后于24 h后觀察平板上微生物的生長(zhǎng)情況，觀察是否有透明圈，顏色變化等。再將產(chǎn)生明顯透明圈的菌落劃線(xiàn)至ISP2固體培養(yǎng)基上，供復(fù)篩用。

1.4.3 復(fù)篩 參考辛宏等（2018）的方法制備人工血栓，取300 μL脫纖維無(wú)菌羊血，至于滅菌西林瓶底部，加入9 μL 1 mol·L1的CaCl3溶液，放置10 min，待血液凝固使用。

將初篩結(jié)果良好的16株細(xì)菌，分別接種于50 mL改良的ISP2液體培養(yǎng)基上，28 ℃，180 r·min1搖床培養(yǎng)7 d;取出發(fā)酵液，8 000 r·min1離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾膜除菌，獲得抗血栓活性待測(cè)液;取2 mL待測(cè)液沿壁緩慢加入凝固的人工血栓中，以2 mL ISP2液體培養(yǎng)基和2 mL 0.7%生理鹽水作陰性對(duì)照，以2 mL 0.173 g·mL1血塞通片（含三七總皂苷含量為100 mg）為陽(yáng)性對(duì)照。放入28 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次血凝塊溶解情況，并輕微晃蕩，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 桐花樹(shù)中內(nèi)生及根際細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色和大小等特征進(jìn)行排重，選取125株細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ确治?，獲得74種細(xì)菌，其中桐花樹(shù)各組織中獲得34種內(nèi)生細(xì)菌，隸屬于18科22屬;根際細(xì)菌44種，隸屬于20科27屬。分別對(duì)桐花樹(shù)的內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1和圖2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生和根際細(xì)菌的分離效果

采用6種培養(yǎng)基，從桐花樹(shù)中分別獲得內(nèi)生和根際細(xì)菌71株和64株;經(jīng)形態(tài)法和16S rRNA基因序列對(duì)比排重后，獲得74株細(xì)菌在6種培養(yǎng)基上分離效果（圖3）。根據(jù)其分離效果分析：P3和P7培養(yǎng)基分離到細(xì)菌種類(lèi)最多，均有17個(gè)菌屬;AGG培養(yǎng)基分離的細(xì)菌種類(lèi)最少，包含4個(gè)菌屬，究其原因可能是AGG培養(yǎng)基主要成分為淀粉，較適合優(yōu)勢(shì)放線(xiàn)菌群（鏈霉菌屬）。由菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，M10、M5、AGG、 M4、P7和P3培養(yǎng)基上菌落數(shù)分別為4.3、3.1、1.2、7.3和7.2（×105 cfu·mL1）。P3和P7培養(yǎng)基分離效果相近，獲得的細(xì)菌均隸屬于17屬，其菌種數(shù)和多樣性均較高;而AGG培養(yǎng)基獲得的細(xì)菌均隸屬于5屬，故其獲得較少的細(xì)菌數(shù)和多樣性。

2.3 內(nèi)生及根際細(xì)菌的屬級(jí)水平上的韋恩圖分析

在屬級(jí)水平上對(duì)桐花樹(shù)各組織和其根際來(lái)源細(xì)菌進(jìn)行venn分析，結(jié)果顯示，從桐花樹(shù)各組織和根際中獲得細(xì)菌種類(lèi)存在較大的差異，桐花樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌共有10個(gè)相同的菌屬，分別為Novosphingobium sp.、Sphingomonas sp.、Gordonia sp.、Micrococcus sp.、Streptomyces sp.、Pseudomonas sp.、Mycolicibacterium sp.、Mycobacterium sp.、Bacillus sp.和Microbacterium sp.。對(duì)桐花樹(shù)各組織與根際來(lái)源的細(xì)菌分別進(jìn)行venn分析，僅有一個(gè)共同的芽孢桿菌屬（圖4：A）;根部分離的細(xì)菌與根際細(xì)菌有8個(gè)共同菌屬（圖4：B），其他各組織分離的細(xì)菌與根際細(xì)菌的種屬相差較大。

2.4 細(xì)菌抗血栓活性初篩

將初篩的羊血平板放置28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)和暈圈情況。結(jié)果顯示，篩選74種細(xì)菌的抗血栓活性，有18種細(xì)菌顯示出良好的抗血栓活性，總陽(yáng)性為24.32%;分別隸屬于Bacillus sp.、Curtobacterium sp.、Demequina sp.、Kineococcus sp.、Pseudomonas sp.和Sphingomonas sp.。圖5顯示，B2061、B2635和B1820顯示無(wú)暈圈，即判定為無(wú)溶血活性;B1502、B1500和B1850顯示出深色暈圈，B1989、B2634和B2632表現(xiàn)為透明圈，兩者均判定為具有溶血活性。

2.5 細(xì)菌上清液對(duì)體外血栓的影響

根據(jù)上述抗血栓活性初篩結(jié)果，對(duì)18株有活性菌株進(jìn)行抗血栓活性復(fù)篩。圖6結(jié)果顯示，24 h后，B1850、B1989和B2632的上清發(fā)酵液將凝血塊全部溶解。其余細(xì)菌的上清液與血凝塊均有明顯分層，凝血塊較空白對(duì)照組的均有變小，上層溶液呈現(xiàn)出紅色，故展示出微弱的溶血活性，ISP2培養(yǎng)基和生理鹽水空白組中凝血塊均維持原樣，下層為凝血塊，固液分界線(xiàn)清晰。

3 討論與結(jié)論

紅樹(shù)植物是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶潮間帶河口地帶的耐鹽植物，分布在30° S與30° N之間。面對(duì)高度鹽漬化、土壤缺氧、高光輻射、高礦物組成、強(qiáng)還原性和頻繁的潮汐等生境特征，紅樹(shù)植物對(duì)生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)變得十分激烈，這一特殊生境豐富了紅樹(shù)林植物內(nèi)生菌多樣性，也必然能代謝出區(qū)別于其他生態(tài)系統(tǒng)的良好生物活性物質(zhì)（周婧等，2019）。據(jù)報(bào)道，紅樹(shù)植物內(nèi)生菌具有良好的抑菌、殺蟲(chóng)、細(xì)胞毒、胞外酶活、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等生物活性（劉偉等，2012;魏華等，2012;李菲等，2016）。桐花樹(shù)作為傳統(tǒng)的中藥，其樹(shù)皮和樹(shù)葉均有治療哮喘、糖尿病和風(fēng)濕等疾病功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗植物病原菌和細(xì)胞毒活性等作用（徐佳佳等，2006），故研究桐花樹(shù)內(nèi)生菌的多樣性和生物活性獲得不少研究工作者的青睞。為了完善桐花樹(shù)中內(nèi)生細(xì)菌分布情況、物種多樣性及其生物活性等信息，本研究選擇廣西北海灘涂上紅樹(shù)植物桐花樹(shù)各組織和根際進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。采用6種分離培養(yǎng)基，對(duì)桐花樹(shù)組織中獲得的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行定量分析，共獲得34種細(xì)菌，隸屬于18科22屬;從根際中分離可培養(yǎng)細(xì)菌44種，隸屬于20科27屬。從桐花樹(shù)各組織中獲得內(nèi)生細(xì)菌在種類(lèi)和數(shù)量均有明顯差異，其中，根部和皮部中分離的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量最多，花和葉中分離到的細(xì)菌均較少;而根部來(lái)源的內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌存在較多相同屬。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物的分布與沿根的可溶性碳的分布距離有關(guān)，其生物量的積累有賴(lài)于根系分泌物的釋放，從而影響著根際微生物的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育（朱麗霞等，2003）。

采用無(wú)菌脫纖維羊血，通過(guò)體外溶栓實(shí)驗(yàn)篩選出具有抗血栓活性菌株。結(jié)果顯示，初篩得到18種具有抗血栓活性的菌株，總陽(yáng)性為24.32%;通過(guò)抗血栓活性復(fù)篩，從中獲得3株具有良好抗血栓活性菌株。該3株強(qiáng)抗血栓活性菌株B1850、B1989和B2632分別隸屬于Microbacterium sp.、Stenotrophomonas sp.和Bacillus sp.。據(jù)報(bào)道，目前已從芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、鏈球菌屬、單胞菌屬及葡萄球菌屬等細(xì)菌中分離出抗血栓活性物質(zhì)（Lack，1948;張艷等，2000），但對(duì)海洋來(lái)源的微生物在抗血栓活性研究領(lǐng)域上的報(bào)道寥寥可數(shù)，本文開(kāi)展海洋來(lái)源細(xì)菌中抗血栓活性研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的具有良好抗血栓活性菌株Microbacterium sp. B1850和Stenotrophomonas sp. B1989，這豐富了海洋微生物在抗血栓活性研究上的認(rèn)識(shí)，也為尋找新的纖溶酶和研發(fā)抗血栓活性藥物等下游工作奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

HUANG S，PAN S，CHEN G，et al.，2013. Biochemical cha-racteristics of a fibrinolytic enzyme purified from a marine bacterium，Bacillus subtilis HQS-3 [J]. Int J Biol Macromol，62：124-130.

HE BY，LAI TH，CHEN JF，et al.，2007. Studies of the tole-rance of Avicennia marina and Aegiceras corniculatum to seawater immersion in Guangxi，China [J]. Acta Ecol Sin，27（3）：1130-1138. [何斌源，賴(lài)廷和，陳劍鋒，等，2007. 兩種紅樹(shù)植物白骨壤（Avicennia marina）和桐花樹(shù)（Aegiceras corniculatum）的耐淹性 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，27（3）：1130-1138.]

JAREMO P，ERIKSSON M，LINDAHLl TL，et al.，2013. Platelets and acute cerebral infarction [J]. Platelets，24（5）：407.

KIM KH，ROH SW，CHANG HW，et al.，2009. Nocardioides basaltis sp. nov.，isolated from Black Beach Sand [J]. Int J Syst Evol Microbiol，59：42-47.

LACK CH，1948. Staphylokinase，an activator of plasma protease [J]. Nature，161（4093）：559.

LAKSHMI BP，PRAKASHAM RS，2013. A fibrinolytic，alkaline and thermostable metalloprotease from the newly isolated Serratia sp. RSPB11 [J]. Int J Biol Macromol，61：479-486.

LI F，GAO CH，YU L，et al.，2018. Diversity and antifungal activity of endophytic and rhizospheric bacteria isolated from Ruppia maritima [J]. Guihaia，38（7）：924-933. [李菲，高程海，余煉，等，2018. 川蔓藻內(nèi)生及根際細(xì)菌多樣性與抑菌活性研究 [J]. 廣西植物，38（7）：924-933.]

LI F，GAO CH，ZHU LB，et al.，2016. Diversity and cytotoxic activity of endophytic bacteria isolated from Sonneratia apetala of Maowei Sea [J]. J Microbiol Sin，56（4）：689-697. [李菲，高程海，竺利波，等，2016. 茅尾海無(wú)瓣海桑內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其細(xì)胞毒活性 [J]. 微生物學(xué)報(bào)，56（4）：689-697.]

LI F，TUO L，SU ZW，et al.，2017. Nocardioides sonneratiae sp. nov.，an endophytic actinomycete isolated from branch of Sonneratia apetala [J]. Int J Syst Evol Microbiol，67：2592-2597.

LI ZQ，HU JC，PAN HQ，et al.，2009. Screening and identification of fibrinolytic enzyme producing marine bacterium B5815 [J]. J Microbiol，29（6）：41-44. [李占強(qiáng)，胡江春，潘華奇，等，2009. 產(chǎn)纖溶酶海洋微生物B5815菌株的篩選及鑒定 [J]. 微生物雜志，29（6）：41-44.]

LIU CG，WEI X，LIU WS，2001. Study on characteristics of fibrilytic enzyme from marine Pseudomonas [J]. J Ocean Univ Qingdao，31（5）：730-734. [劉晨光，魏香，劉萬(wàn)順，2001. 海洋假單胞菌纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究 [J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，31（5）：730-734.]

LIU W，NI H，HUANG GL，et al.，2012. Screening of endophytic fungi with antibacterial，antioxidant and antitumor activities from Mangrove plants [J]. Acta Laser Biol Sin，21（6）：569-574. [劉偉，倪輝，黃高凌，等，2012. 從紅樹(shù)植物中篩選具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌 [J]. 激光生物學(xué)報(bào)，21（6）：569-574.]

MIU SY，CHEN GZ，LI HS，2007. Wetland systems of mangrove plants Aegiceras corniculatum and Avicennia marina [M]. Guangzhou：Sun Yat-Sen University Press. [繆紳裕，陳桂珠，李海生，2007. 紅樹(shù)林植物桐花樹(shù)和白骨壤及其濕地系統(tǒng) [M]. 廣州：中山大學(xué)出版社.]

WALSH PS，METZGER DA，HIGUCHI R，1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of dna for pcr-based typing from forensic material [J]. Biotechniques，10（4）：506-513.

QIAO DS，HUO JL，YANG TY，et al.，2009. Advances in the studies of biochemical antithrombotics [J]. Pharmaccut Biotechnol，16（5）：477-480. [喬德水，霍建麗，楊天雨，等，2009. 抗血栓生化藥物的研究進(jìn)展 [J]. 藥物生物技術(shù)，16（5）：477-480.]

SUN Y，JIANG J，ZHANG Z，et al.，2008. Antioxidative and thrombolytic TMP nitrone for treatment of ischemic stroke [J]. Bioorg Med Chem，16（19）：8868-8874.

WANG YH，YANG XT，YANG MJ，et al.，2010. Diversity and application of microbial fibrinolytic enzymes [J]. Prog Mod Biol，10（8）：1562-1565. [翁郁華，楊曉彤，楊明俊，等，2010. 微生物纖溶酶的多樣性及應(yīng)用前景 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，10（8）：1562-1565.]

WEI H，LIU M，BAO SX，et al.，2012. Screening and characterization of anti-root-knot nematode actinomycetes strain from mud under mangrove （Rhizophora） forest [J]. J Microbiol，32（4）：13-16. [魏華，劉敏，鮑時(shí)翔，等，2012. 1株抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)紅樹(shù)林放線(xiàn)菌的篩選與鑒定 [J]. 微生物學(xué)雜志，32（4）：13-16.]

WEN CY，WU YH，TIAN XL，2004. Recent advances and issues on the endophyte [J]. Chin J Ecol，23（2）：86-91. [文才藝，吳元華，田秀玲，2004. 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問(wèn)題 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志，23（2）：86-91.]

XIN H，XUE SS，JIANG LM，et al.，2018. Screening of marine microbial antithrombotic strains from Naozhou island in South China Sea and its effect on blood coagulation characteristics [J]. J Bengbu Med Coll，43（7）：850-853. [辛宏，薛珊珊，江黎明，等，2018. 中國(guó)南海硇洲島海洋微生物抗血栓菌株的篩選及其對(duì)血液凝固特性的影響 [J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，43（7）：850-853.]

XU JJ，LONG SJ，2006. Research overview of chemical consti-tuents and biological activity of the Aegiceras corniculatum [J]. Lishizhen Med Mat Med Res，17（12）：2393-2395. [徐佳佳，龍盛京，2006. 桐花樹(shù)化學(xué)成分及其生物活性作用的研究進(jìn)展 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，17（12）：2393-2395.]

ZHANG Y，LI WP，MING L，et al.，2000. Effects of r-Sak on thrombolysis in rabbits and rats [J]. Chin Pharm Bull，16（2）：187-189. [張艷，李衛(wèi)平，明亮，等，2000. 重組葡激酶溶栓作用的研究 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，16（2）：187-189.]

ZHOU J，YANG Q，LI G，et al.，2019. Advances in endophytic fungi diversity and secondary metabolites in Rhizophora plants [J]. Sci Silv Sin，55（1）：92-105. [周婧，楊琦，李鋼，等，2019. 紅樹(shù)屬植物內(nèi)生真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展 [J]. 林業(yè)科學(xué)，55（1）：92-105.]

ZHOU SQ，HUANG XL，HUANG DY，et al.，2010. A rapid method for extracting DNA from actinomycetes by Chelex-100 [J]. Biotechnol Bull，26（2）：123-125. [周雙清，黃小龍，黃東益，等，2010. Chelex-100快速提取放線(xiàn)菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)，26（2）：123-125.]

ZHU LX，ZHANG JE，LIU WG，2003. Review of studies on interactions between root exudates and rhizopheric microorga-nisms [J]. Ecol Environ，12（1）：102-105. [朱麗霞，章家恩，劉文高，2003. 根系分泌物與根際微生物相互作用研究綜述 [J]. 生態(tài)環(huán)境，12（1）：102-105.]

（責(zé)任編輯 周翠鳴）