林俊 趙英光

摘要 為研究性別對家禽糞便微生物的影響，選擇成年雞、鴨和鵝為試驗動物，在相同飼養(yǎng)條件下飼喂相同的飼料28 d后，收取新鮮糞樣后檢測糞便樣品的16S rDNA的V4區(qū)，分析群落多樣性和豐度，并進行差異菌落功能注釋。結(jié)果表明，性別對雞和鴨糞便α微生物多樣性有顯著或極顯著影響（P<0.05或P<0.01），而對鵝糞便微生物多樣性沒有顯著影響;β多樣性分析結(jié)果表明，飼喂相同的飼料給不同性別的家禽（雞、鴨、鵝），不同性別的家禽糞便中微生物群落組成和結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別;不同性別的雞、鴨和鵝糞便微生物中50、78和247個屬的微生物豐度有顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01）;大量的差異屬微生物的功能聚集在代謝、免疫功能等方面。該研究表明性別對雞、鴨和鵝糞便中微生物多樣性和豐度有顯著或極顯著影響（P<0.05或P<0.01），進而影響糞便的功能和宿主。

關(guān)鍵詞 糞便微生物;多樣性;性別;雞;鴨;鵝

中圖分類號 S811.6 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）03-0085-04

Abstract In order to investigate the effects of gender on the fecal microbe in poultry， we selected adult chicken， ducks and geese as experimental animals. In the same environment， those animals were reared with the same diet for 28 days， fresh fecal were collected to detect the V4 region of 16S rDNA in fecal samples and analyze the community diversity and abundance. And differential colony function annotation was made. The results showed that gender had significant or extremely significant effects on alpha microbial diversity in the feces of chicken and ducks （P<0.05 or P<0.01）， but it had no significant effect on the microbial diversity in goose feces.The results of beta diversity analysis showed that there were significant differences in the composition and structure of microbial communities in feces microbe in different genders of chicken， duck or goose with feeding the same feed. There were significant or extremely significant differences of microbial abundance in 50， 78 and 247 genera in the feces of chicken， ducks and geese between different genders （P<0.05 or P<0.01）. A large number of differences in the microbial function were concentrated in the metabolism， immune function and so on.In conclusion， gender had significant or extremely significant effects （P<0.05 or P<0.01） on microbial diversity and microbial abundance in the feces of chicken， duck and goose， which affected fecal function and host.

Key words Fecal microbe;Diversity;Gender;Chicken;Duck;Goose

腸道微生物影響宿主的營養(yǎng)、免疫、生產(chǎn)性能、生理狀態(tài)和疾病等過程[1]。微生物通過發(fā)酵、消化等過程消化飼料中的淀粉、纖維素等物質(zhì)，為機體提供短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）、氨基酸和維生素等[2]，并通影響?zhàn)つし置诿庖咔虻鞍谆蚍翘禺愋悦庖摺⒚庖邞?yīng)答等過程而提高機體的健康狀況或生產(chǎn)性能[3]。性別、環(huán)境、日齡和飼糧等因素均影響腸道菌群。研究發(fā)現(xiàn)，同一物種不同性別在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過程中分泌的激素、調(diào)控的基因不同，會影響腸道微生物的組成和物種多樣性[4]。關(guān)于哺乳動物的研究表明，性別影響腸道微生物T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細胞因子產(chǎn)生的不同反應(yīng)[5]，小腸中的微生物參與小腸的免疫反應(yīng)[6];對哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn)，性別影響腸道微生物組成[7]，進一步研究發(fā)現(xiàn)性別主要是通過不同性別腸道微生物中的擬桿菌-普雷沃菌（Bacteroides-Prevotella）的差異而造成不同影響[8]。筆者選擇雞、鴨和鵝飼喂28 d相同飼糧后收集糞便樣品，并利用高通量測序技術(shù)檢測分析群落多樣性和組成成分，對差異菌落進行基因功能注釋，分析性別對糞便微生物的影響，旨在為后續(xù)研究禽類微生物的組成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇30只成年雞（15♂、15♀）、30只成年鴨（15♂、15♀）和26只成年鵝（12♂、14♀）在重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校家禽科研基地進行飼養(yǎng)。所有動物都飼養(yǎng)在相同的試驗條件下，每天飼喂相同的全價飼料（表1），飼喂量為200 g/（d·只），飼喂28 d后將試驗個體放置在無菌的塑料薄膜上，并收集糞便樣品凍存在干冰中，隨后凍存在-80 ℃。

1.2 糞便微生物測序

對雞、鴨和鵝所有糞便微生物基因組進行測序，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時使用紫外分光光度計對DNA進行定量。添加樣本特異性Barcode序列后，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶對rRNA基因V4可變區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進行回收?；厥盏钠尾捎肐llumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，并在以Illumina MiSeq測序為例。具體測序步驟參照文獻[9]。

1.3 糞便微生物多樣性分析

數(shù)據(jù)下機后按文獻[10]中流程進行過濾，使用QIIME軟件過濾后的數(shù)據(jù)按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列[11]，根據(jù)OTU的數(shù)目構(gòu)建各樣本中豐度的矩陣文件。隨后利用QIIME軟件（默認參數(shù)）通過將OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫[12]（Greengenes、Silva、UNITE）的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。

樣品均一化處理后（OTU豐度矩陣中的所有樣本在90%的最低測序深度水平統(tǒng)一進行隨機重抽樣），使用QIIME軟件分別對每個樣本計算α多樣性（Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)）。PCA分析通過線性變換，將原始的高維數(shù)據(jù)（如菌群OTU豐度矩陣）通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標系（即主成分）中，從而達到降維、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的目的，展現(xiàn)樣本的自然分布[13]。PCA分析能夠從原始數(shù)據(jù)中提取樣本間最主要的差異特征，通過對PCA分析得到的前二維或三維數(shù)據(jù)作圖，可得出群落樣本的主要分布特征，從而量化樣本間的差異和相似度。

1.4 差異菌種功能注釋

利用PICRUSt軟件對上述差異的菌屬進行預(yù)測分析[14]。根據(jù)已測微生物基因組的16S rRNA基因全長序列，推斷它們共同祖先的基因功能譜;對Greengenes 16S rRNA基因全長序列數(shù)據(jù)庫中其他未測物種的基因功能譜進行推斷，構(gòu)建古菌和細菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜;將測序得到的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對，尋找每一條測序序列的“參考序列最近鄰居”，并歸為參考OTU;根據(jù)“參考序列最近鄰居”的rRNA基因拷貝數(shù)，對獲得的OTU豐度矩陣進行校正;最后，將菌群組成數(shù)據(jù)“映射”到已知的基因功能譜數(shù)據(jù)庫中，實現(xiàn)對菌群代謝功能的預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列統(tǒng)計和物種注釋結(jié)果

對雞、鴨和鵝共86份糞便樣品微生物的16S rDNA的V4區(qū)進行了測序，分別在母雞、公雞、母鴨、公鴨、母鵝和公鵝群體中分別發(fā)現(xiàn)445 998、435 385、377 744、531 451、489 023和357 468個OTU序列。研究結(jié)果表明，不同性別的雞、鴨和鵝群體中共有該物種大多數(shù)的糞便微生物，但雌性群體中都發(fā)現(xiàn)更多種類的OTU序列（圖1）。

2.2 多樣性分析

利用α和β多樣性指數(shù)研究性別對雞、鴨和鵝糞便微生物多樣性和群落組成進行研究。進一步利用Chao1指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)估算雞、鴨和鵝糞便微生物的α多樣性，發(fā)現(xiàn)在母雞、母鴨群體糞便中的微生物多樣性均極顯著高于公雞和公鴨，但母鵝和公鵝糞便微生物多樣性差異不顯著（圖2 A～C）。β多樣性分析表明，雞、鴨和鵝腸道的微生物群落有明顯區(qū)別（圖2 D～F）。綜上所述，性別對雞和鴨糞便微生物多樣性有顯著影響，對雞、鴨、鵝糞便微生物的群落組成有明顯影響。

2.3 性別對腸道微生物豐度及功能的影響

在門和屬水平上，同一物種的不同性別家禽群體糞便腸道微生物有顯著差異。研究表明，不同性別雞群體的糞便微生物11個門50個屬豐度有顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01）;母鴨和公鴨群體糞便腸道微生物中有10個門78個屬的微生物豐度有顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01）;不同性別的鵝群體中糞便微生物有3個門24個屬的腸道微生物豐度差異顯著或極顯著（P<0.05或P<0.01）（圖3 A～C）。對上述雞、鴨和鵝不同性別間的腸道微生物進行基因功能注釋，結(jié)果表明性別對雞、鴨和鵝糞便的功能有一定影響，特別是能量代謝、脂類代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝等都有顯著或極顯著影響（圖3 D～F）。

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)性別對雞和鴨腸道微生物群落多樣性、微生物豐度及功能均有顯著或極顯著影響（P<0.05或P<0.01）。哺乳動物的相關(guān)研究表明，性別對腸道微生物的群落、組成和多樣性均有顯著影響[15]。該研究發(fā)現(xiàn)，鵝糞便微生物β多樣性在不同性別間沒有極顯著差異，因此性別對腸道微生物的影響因性別而異。

哺乳動物的相關(guān)研究表明，腸道微生物的群落組成和多樣性受到性激素的調(diào)控，并參與宿主免疫疾病和代謝等過程[16]。該研究發(fā)現(xiàn)，在門和屬水平的優(yōu)勢菌群在同一物種的不同性別間是一致的，但菌群的豐度具有一定的偏好性，在屬水平上雞有大量的菌屬豐度顯著差異，有大量的屬參與到碳水化合物消化生成短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）的過程中，例如擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、巨球型菌屬（Megasphaera）、消化球菌屬（Peptococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus）[17]，SCFA主要來自大腸內(nèi)碳水化合物的發(fā)酵和蛋白質(zhì)降解，腸道菌群通過產(chǎn)生SCFA對人體多個器官和代謝產(chǎn)生影響。SCFA對宿主有重要的生理功能，如調(diào)節(jié)腸道菌群、維持體液和電解質(zhì)的平衡、為宿主提供能量、促進消化道細胞生長、誘導(dǎo)細胞分化、影響宿主消化道組織基因表達等重要作用[18]。上述研究結(jié)果表明不同性別家禽分泌的性激素不同，會影響腸道菌群以及糞便微生物的組成和豐度，并最終影響腸道終產(chǎn)物SCFA，進而影響宿主的健康。進一步研究發(fā)現(xiàn)，糞便微生物的差異功能注釋也表明雞、鴨和鵝腸道微生物功能在代謝和免疫等方面有顯著差異。前期研究結(jié)果表明宿主和微生物共同作用消化碳水化合物和纖維素飼料食物[19]。

4 結(jié)論

性別對雞、鴨的糞便微生物的多樣性有顯著或極顯著影響（P<0.05或P<0.01），在屬水平上發(fā)現(xiàn)大量的差異菌群的豐度有顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01），進而影響到腸道微生物的功能。

參考文獻

[1] BAJAJ J S，IDILMAN R，MABUDIAN L，et al.Diet affects gut microbiota and modulates hospitalization risk differentially in an international cirrhosis cohort[J].Hepatology，2018，68（1）：234-247.

[2] LEBLANC J G，MILANI C，DE GIORI G S，et al.Bacteria as vitamin suppliers to their host：A gut microbiota perspective[J].Curr Opin Biotech，2013，24（2）：160-168.

[3] ROSSHART S P，VASSALLO B G，ANGELETTI D，et al.Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance[J].Cell，2017，171（5）：1015-1028.

[4] KOVACS A，BENJACOB N，TAYEM H，et al.Genotype is a stronger determinant than sex of the mouse gut microbiota[J].Microb Ecol，2011，61（2）：423-428.

[5] YERETSSIAN G，DOIRON K，SHAO W，et al.Gender differences in expression of the human caspase12 long variant determines susceptibility to Listeria monocytogenes infection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（22）：9016-9020.

[6] ROUND J L，MAZMANIAN S K.The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J].Nat Rev Immunol，2009，9（5）：313-323.

[7] DICKSVED J，F(xiàn)LISTRUP H，BERGSTRM A，et al.Molecular fingerprinting of the fecal microbiota of children raised according to different lifestyles[J].Appl Environ Microbiol，2007，73（7）：2284-2289.

[8] MUELLER S，SAUNIER K，HANISCH C，et al.Differences in fecal microbiota in different European study populations in relation to age，gender，and country：A crosssectional study[J].Appl Environ Microbiol，2006，72（2）：1027-1033.

[9] LIU L，ZHAO X，WANG Q，et al.Prosteatotic and protective components in a unique model of fatty liver：Gut microbiota and suppressed complement system[J].Sci Rep，2016，6：1-14.

[10] GAO G L，ZHAO X Z，LI Q，et al.Genome and metagenome analyses reveal adaptive evolution of the host and interaction with the gut microbiota in the goose[J].Sci Rep，2016，6：1-11.

[11] EDGAR R C.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics，2010，26（19）：2460-2461.

[12] KLJALG U，NILSSON R H，ABARENKOV K，et al.Towards a unified paradigm for sequencebased identification of fungi[J].Mol Ecol，2013，22（21）：5271-5277.

[13] RAMETTE A.Multivariate analyses in microbial ecology[J].FEMS Microbiol Ecol，2007，62（2）：142-160.

[14] LANGILLE M G I，ZANEVELD J，CAPORASO J G，et al.Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences[J].Nat Biotechnol，2013，31（9）：814-821.

[15] DOMINIANNI C，SINHA R，GOEDERT J J，et al.Sex，body mass index，and dietary fiber intake influence the human gut microbiome[J].Plos One，2015，10（4）：1-14.

[16] MARKLE J G，F(xiàn)RANK D N，ADELI K，et al.Microbiome manipulation modifies sexspecific risk for autoimmunity[J].Gut microbes，2014，5（4）：485-493.

[17] XU J，CHEN H B，LI S L.Understanding the molecular mechanisms of the interplay between herbal medicines and gut microbiota[J].Med Res Rev，2017，37（5）：1140-1185.

[18] KOH A，DE VADDER F，KOVATCHEVADATCHARY P，et al.From dietary fiber to host physiology：Shortchain fatty acids as key bacterial metabolites[J].Cell，2016，165（6）：1332-1345.

[19] HIRD S M.Evolutionary biology needs wild microbiomes[J].Front Microbiol，2017，8：1-10.