郭亞娟　付曉燕　王武強(qiáng)　白娜　陳江

摘 要：本文建立了一套超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中10種氨基糖苷類(lèi)藥物殘留的方法。通過(guò)比較不同提取試劑和提取方式下目標(biāo)物的回收率，優(yōu)化前處理方式。采用Agela Technologies HILIC色譜柱（2.1×100 mm，3 μm），以0.1%甲酸甲酸銨溶液和0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相，在ESI+模式下采用選擇離子監(jiān)測(cè)方式（SRM），基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在50～4 000 mg·L-1范圍內(nèi)10種氨基糖苷類(lèi)藥物線(xiàn)性良好（R2>0.999 0），3種不同濃度的加標(biāo)在動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟中的回收率為71.5%～102%，RSD為3.8%～13.2%，在動(dòng)物副產(chǎn)物中的回收率為65.5%～100%，RSD為2.0%～14.2%。該方法準(zhǔn)確可靠，通用性強(qiáng)，可用于多種動(dòng)物源性食品中10種氨基糖苷類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物原性食品;氨基糖苷類(lèi)藥物;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract：A method was developed for the determination of aminoglycosides residues in foods of animal-derived foods by Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. By comparing the recovery of the target substance under different extraction reagents and methods， the pretreatment method was optimized. Used the Agela Technologies HILIC column （2.1×100 mm， 3 μm）， 0.1% ammonium formate solution and 0.1% acetonitrile solution were used as mobile phase， and selected ion monitoring （SIM） was used in ESI+ mode. The results showed that the linearity of ten aminoglycosides was good in the range of 50～4 000 mg·L-1 （R2>0.999 0）. The recoveries of three different concentrations of aminoglycosides in animal muscle and viscera were 71.5%～102%， the RSD ranged 3.8%～13.2%， the recovery of animal by-products ranged 65.5%～100% ， and the RSD ranged 2.0%～14.2%. The method is accurate， reliable and versatile， and can be used for the determination of 10 aminoglycosides residues in various animal-derived foods.

Key words：Animal food; Aminoglycosides; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

中圖分類(lèi)號(hào)：R155.5

氨基糖苷類(lèi)藥物是一種廣譜類(lèi)抗生素，主要用于治療細(xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染。由于該類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解，在動(dòng)物組織中容易殘留，給人類(lèi)帶來(lái)巨大的危害[1-2]。所以，建立一套完善、覆蓋面廣又便于使用的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前報(bào)道的氨基糖苷類(lèi)藥物檢測(cè)方法有HPLC-UV[3-4]、LC-MS[5-6]和HPLC-ELSD法[7]檢測(cè)。但大多采用了離子對(duì)試劑且基質(zhì)單一[7-9]。本文采用2%乙腈溶液作為提取溶液，用特定濃度的甲酸銨溶液代替七氟丁酸，在提供了電離所需的離子外，增強(qiáng)了目標(biāo)物的保留，達(dá)到有效分離和檢測(cè)的目的。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

（1）儀器。AB SCIEX QTRAP 4500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、Mettler Toledo電子天平、VORTEX-6旋渦混合器、AS30600BT超聲水浴搖床、3K15高速冷凍離心機(jī)、TTL-DCⅡ氮吹濃縮儀。

（2）試劑。乙腈、甲酸為HPLC級(jí)，其他試劑均為分析純。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品。10種氨基糖苷類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品：慶大霉素（GEN）、鏈霉素（STR）、雙氫鏈霉素（DISTR）、卡那霉素（KAN）、潮霉素B（HYG）、壯觀霉素（SPE）、安普霉素（AMI）、妥布霉素（TOB）、新霉素（NEO）、巴龍霉素（PAR），所有標(biāo)品均來(lái)自德國(guó)Dr.ehrenstorfer公司。

（4）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10種氨基糖苷類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（根據(jù)標(biāo)品純度折算）于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃待用。

（5）標(biāo)準(zhǔn)工作液。選取豬肉、雞肝、魚(yú)肉、雞蛋、牛奶、蜂蜜等具有代表性的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn) 工作液，其中SPE、DISTR、STR、KAN、TOB、GEN、PAR的工作液濃度為50、100、200、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1;

HYG、APR、NEO的工作液濃度為200、500、1 000、2 000 ng·mL-1和4 000 ng·mL-1。

（6）磷酸緩沖溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫鉀1.36 g，用980 mL水溶解，用1.0 mol·L-1鹽酸調(diào)pH到4.0，分別加入Na2EDTA 0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解混勻并定容至1 000 mL（4℃避光保存）。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

Agela Technologies HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）;流速：0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量：2 μL;柱溫：35 ℃;流動(dòng)相A：0.1%甲酸甲酸銨溶液（含30 mmol·mL-1甲酸銨），流動(dòng)相B：1%的甲酸乙腈溶液（含1 mmol·mL-1甲酸銨）;梯度洗脫程序：0～1 min，10%流動(dòng)相A+90%流動(dòng)相B;1～5 min，流動(dòng)相A 10%～97%;5～7 min，97%流動(dòng)相A保持2 min;7.1～8 min，流動(dòng)相A 97%～10%;8.1～12 min，10%流動(dòng)相A保持。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離離子源（ESI）;SRM模式：正離子掃描;噴霧電壓：5.5 kV;毛細(xì)管溫度：550 ℃;霧化氣壓力（GS1）：50 psi;輔助氣壓力（GS2）：50 psi;氣簾氣壓力（CUR）：25 psi;碰撞氣壓力（CAD）：8 psi。

1.3 樣品前處理

（1）動(dòng)物肌肉、動(dòng)物內(nèi)臟。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 2%甲酸乙腈提取液（pH為3±0.1），超聲提取20 min，離心取上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液。準(zhǔn)確吸取10 mL過(guò)WCX凈化樣品，用3 mL 5%的氨水溶液、3 mL 100%甲醇依次淋洗，3 mL 5%甲酸甲醇，收集洗脫液，40 ℃氮吹至盡干，1 mL流動(dòng)相A定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

（2）水產(chǎn)品、牛奶、雞蛋。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，沉淀蛋白，提取方式同動(dòng)物肌肉。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

氨基糖苷類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基和羥基，故呈堿性，極性和水溶性較高，所以在選取提取液時(shí)，分別比較了磷酸緩沖液、0.1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈（pH為3.0±0.1）等酸化提取液。結(jié)果如圖1所示，0.1%甲酸乙腈的提取效果最差，磷酸緩沖液和2%甲酸乙腈提取液（pH為3.0±0.1）效果相當(dāng)，但是基于乙腈有沉淀蛋白的效果，最終選擇使用2%甲酸乙腈（pH為3.0±0.1）作為提取溶液。

2.2 凈化方式的優(yōu)化

分別比較了Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Waters Oasis WCX（60 mg，3 mL）、Waters Oasis MCX

（60 mg，3 mL）3種不同類(lèi)型凈化小柱的回收率，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，氨基糖苷類(lèi)化合物在HLB上基本無(wú)保留，在MCX上很難洗脫下來(lái)，而在WCX有很好的保留，同時(shí)也能達(dá)到較好的凈化效果。之后我們又根據(jù)回收率優(yōu)化了洗脫液和淋洗液，最終選擇5%氨水溶液作為淋洗液，5%甲酸甲醇溶液作為洗脫液。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本文考察了C18和HILIC兩種不同色譜柱對(duì)10種氨基糖苷類(lèi)藥物殘留的分離效果。結(jié)果表明，氨基糖胺類(lèi)化合物在C18色譜柱上不易保留，出峰時(shí)間太早，容易引起基質(zhì)干擾;而在HILIC色譜柱上得到了較好的保留，出峰時(shí)間明顯推后，且峰型尖銳，見(jiàn)圖3。故選用HILIC色譜柱。

分別比較了水-乙腈、甲酸水-乙腈以及甲酸甲酸銨-乙腈不同流動(dòng)相對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物響應(yīng)及峰型的影響，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入甲酸后，目標(biāo)化合物的電離效果明顯提高，而加入甲酸銨緩沖液后，有利于穩(wěn)定電離所需的酸性環(huán)境，所以最終確定選用以0.1%甲酸甲酸銨溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò)優(yōu)化每個(gè)化合物的錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，選擇響應(yīng)最高的離子作為定量離子，次之作為定性離子，見(jiàn)表1。

2.5 方法的線(xiàn)性范圍、檢出限、回收率以及精密度

由于此類(lèi)化合物基質(zhì)抑制效果明顯，本方法采用基質(zhì)配標(biāo)，外標(biāo)法定量的方法，對(duì)10種氨基糖苷類(lèi)藥物進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)物的濃度作為橫坐標(biāo)，待測(cè)物的峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、巴龍霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素在50～1 000 mg·L-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，新霉素、潮霉素B、安普霉素在200～

4 000 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性，選擇基質(zhì)抑制最強(qiáng)的空白基質(zhì)，添加不同濃度的質(zhì)量濃度，以其3倍信噪比

（S/N）確定其中壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、巴龍霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素的檢出限LOD為20 μg·kg-1;新霉素、潮霉素B、安普霉素的檢出限LOD為100 μg·kg-1，見(jiàn)表2。

選取空白基質(zhì)樣品，通過(guò)添加低、中、高3種不同濃度質(zhì)量濃度（LOQs、2×LOQs、3×LOQs），按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行。結(jié)果表明，10種氨基糖苷類(lèi)藥物的回收率在65.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.0%～14.2%。滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本文采用2%甲酸乙腈作為提取溶劑，用WCX凈化柱進(jìn)行凈化處理，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中甲酸、甲酸銨以及乙腈的配比，成功建立了一套不使用七氟丁酸離子對(duì)試劑，也能高效檢測(cè)氨基糖苷類(lèi)藥物殘留的方法。本文同時(shí)考察了雞蛋、牛奶、蜂蜜、動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟等可能檢出氨基糖苷類(lèi)藥物殘留的所有動(dòng)物源性食品，基質(zhì)覆蓋面廣，是一套準(zhǔn)確、高效、通用性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

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