康 燕，孫 琳，吳 婷，杜一平

(華東理工大學 化學與分子工程學院 分析測試中心，上海 200237)

表面增強拉曼散射(Surface enhancement Raman scattering,SERS)是由拉曼光譜衍生出來的一種新型的高靈敏光譜技術，是在粗糙化的貴金屬(如納米金、銀等)襯底上產(chǎn)生的、通過局域表面等離子共振而放大的拉曼信號[1-4]。通過這種技術，能將常規(guī)的拉曼信號增強十萬到百萬倍，極大地提高拉曼光譜的靈敏度，使得拉曼光譜能夠用于痕量化合物分析。近年來，人們開始將SERS技術與各種技術聯(lián)用，充分利用SERS的優(yōu)點并擴大其應用范圍，如將SERS與原子力顯微鏡[5]、微流控技術[6]等聯(lián)用。但是，由于光譜技術不具備分離功能，無法對混合體系的譜峰進行歸屬，從而使得SERS技術在復雜體系分析中受到限制。

薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)是一種能夠?qū)旌衔镞M行快速分離的色譜技術，因具有簡單、價廉、分離速度快等優(yōu)點而被廣泛應用[7-9]。TLC方法作為經(jīng)典的分離分析方法，具有很多優(yōu)點，但將其用于定性鑒別時靈敏度低，分析能力差，結果穩(wěn)定性欠佳。將TLC和SERS聯(lián)用，充分結合了TLC技術經(jīng)濟、快捷、高效的優(yōu)點和SERS靈敏度高、指紋信息豐富的特點。目前，TLC-SERS已經(jīng)應用于醫(yī)藥、環(huán)境、考古、食品安全等領域。朱青霞等[10]用TLC-SERS技術對降糖類中成藥中非法添加的4種化學藥品進行了檢測；呂迪亞等用此方法對減肥類中成藥中摻假的麻黃堿及其類似物進行了檢測[11]。傳統(tǒng)中草藥鉤藤中的活性成分異鉤藤堿也可經(jīng)薄層色譜分離后利用SERS技術進行快速檢測[12]。TLC-SERS技術對藥物的現(xiàn)場快速打假有重大意義，不僅有利于維護藥品市場秩序，也有利于保障人民群眾用藥安全。除了在藥物領域的應用外，TLC-SERS也被應用于環(huán)境領域，渠陸陸等[13]采用TLC-SERS技術對河水中10多種芳香族污染物進行了定性和半定量分析。該技術也同樣被成功應用于對古油畫上的有機染料成分進行分離和檢測[14]。Tan等[15]將該聯(lián)用技術用于海產(chǎn)品中組織胺的定量分析。在前期工作中，本課題組將TLC-SERS技術成功應用于果蔬中農(nóng)殘的分析檢測[16-17]。盡管TLC-SERS具有很多優(yōu)點，適合快速分離分析，但由于TLC的分離效率不高，難以應用于成分復雜的樣本。此外，當采用溶膠作為SERS基底時，納米顆粒的不可控團聚也使得這種聯(lián)用方法的重復性較差。為使TLC-SERS適用于更復雜的樣本分析，本文采用二維TLC技術進一步提高分離效率；同時，在SERS基底的可控制備方面，采用金納米粒子修飾的介孔二氧化硅來提高基底的穩(wěn)定性和重復性。

糖精鈉化學名鄰苯甲?；酋啺封c，是食品中常用的合成甜味劑，使用范圍廣泛。糖精鈉的甜度比蔗糖高300～500倍，但其在人體內(nèi)不被分解，對人體無任何營養(yǎng)價值，且會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退。中國消費者協(xié)會對國內(nèi)近百種不同類型、檔次飲料的調(diào)查表明，大約有55.1%的飲料中含有糖精鈉[18]。此外，GB/T 2760-2014 標準明文規(guī)定禁止在鮮果中添加糖精鈉[19]，但是水果中添加糖精鈉增加甜度的現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴重危害消費者的健康。因此，建立快速的、高選擇性的糖精鈉分析方法，為食品安全保駕護航，具有實際意義。

本工作將構建的二維TLC-SERS技術成功應用于飲料和水果中糖精鈉的分析，開發(fā)了一種新的糖精鈉快速分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Santa Barbara Amorphous-15，浙江嘉興探驪新材料研發(fā)有限公司)。對巰基苯胺(PATP)、羅丹明6G(R6G)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。糖精鈉購于上海賢鼎生物科技有限公司。氯金酸、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、乙腈、異丙醇、乙醇、甲醇、甲酸、磷酸、正己烷、氨水、正丁醇、乙醚、二氯甲烷均為分析純，購于國藥(集團)化學試劑有限公司。實驗中使用的薄層層析板從上海集聚盛化工有限公司采購。所有溶液均用超純水設備Sartorius arium 611 DI( Germany )制備的Milli-Q水配制(電導率18 MΩ·cm)。飲料和水果購于超市。

InVia激光顯微拉曼光譜儀(英國Renishaw公司)：激發(fā)光源514.5 nm，Ar+離子激光器，光柵刻線 1 800 l/mm?；椎谋砻嫘蚊灿脪呙桦娮语@微鏡(Scanning electron microscope,SEM)(S-4800，Hitachi，Japan)進行表征。

1.2 金溶膠合成

金溶膠的合成方法參照文獻[20]，在250 mL燒瓶中加熱50 mL 1 mmol/L的氯金酸溶液至沸騰狀態(tài)，加入1.85 mL 38.8 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰回流加熱15 min，待冷卻后裝入棕色試劑瓶中保存待用，制得的金溶膠呈酒紅色。

1.3 Au@ SBA-15 SERS材料的制備

將60 mg SBA-15 分散于80 mL異丙醇中并攪拌均勻，加入1 mL氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)原液，然后在氮氣保護下將混合物加熱至接近回流(約80 ℃)并攪拌8 h，將固體過濾，并用無水乙醇和去離子水分別洗滌3次后于80 ℃干燥12 h，得到氨基改性SBA-15 介孔材料。取30 mg 改性SBA-15粉末于5 mL具塞式離心管中，加入2 mL去離子水，超聲分散均勻，加入2 mL金溶膠，在振蕩器上以1 000 r/min振蕩1 h后靜置，即得金納米顆粒修飾的SBA-15(Au@SBA-15)[21]材料。最后用去離子水沖洗，以去除未負載到材料上的金納米顆粒。

1.4 飲料及水果中糖精鈉的分離與檢測

市售飲料加熱除去CO2后再進行檢測。在薄層板下端1 cm處，用點樣毛細管點上處理好的樣品，第一次展開以乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶1，體積比)為展開劑，將點好的薄層板放入盛有展開劑的展開槽中，展開劑液層約0.5 cm，并預先已達到飽和狀態(tài)。待第一次展開完成后，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，沿著另一個方向進行第二次展開，第二次展開采用正丁醇-氨水-無水乙醇(7∶1∶2，體積比)為展開劑，展開后將Au@SBA-15基底滴灑在薄層斑點原位(紫外燈下觀察)，采集斑點位置的SERS光譜。

對于水果中糖精鈉的檢測，樣品處理如下：取紅棗于攪拌機中攪成勻漿狀，稱取10 g于50 mL具塞離心管中，加入40 mL甲醇，振蕩8 min，超聲提取8 min，3 000 r/min離心，取上層清液，用雙層濾紙過濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。第一次展開采用乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶0.5，體積比)為展開劑，將點好的薄層板放入盛有展開劑的展開槽中，展開劑液層約0.5 cm，并預先已達到飽和狀態(tài)。待第一次展開完成后，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，沿著另一個方向進行第二次展開，第二次展開采用正丁醇-氨水-無水乙醇(7∶2∶2，體積比)為展開劑，展開后將Au@SBA-15基底滴灑在薄層斑點原位(紫外燈下觀察)，采集斑點位置的SERS光譜。

2 結果與討論

2.1 SERS材料(Au@SBA-15)的表征

按照“1.3”方法對SBA-15介孔材料進行氨基改性，材料修飾金納米顆粒前后的SEM圖見圖1。從圖中可以看出，大量的金納米顆粒均勻地分散在介孔材料表面，說明改性材料對納米顆粒的親和力高，可形成足夠的SERS活性位點。

圖1 SBA-15(A)和Au@SBA-15(B)的SEM圖

圖2 不同濃度R6G的SERS譜圖

2.2 基底的靈敏度與點-點重復性

本文采用R6G來考察基底的SERS活性。圖2為不同濃度R6G在Au@SBA-15材料上的SERS譜圖。由圖可以看出，隨著R6G分子濃度的降低，SERS信號逐漸減弱，但R6G濃度為10-10mol/L時仍然能夠清晰地觀察到其特征信號，說明此基底具有良好的SERS活性。

良好的SERS基底的均勻性(點-點重復性)是固相基底的一個重要指標。為了驗證基底不同位置之間增強能力的差異，對基底進行mapping掃描。隨機選擇1個基底，采用10-7mol/L PATP作為探針分子，選擇12 μm×20 μm大小的區(qū)域，每個點間隔4 μm，采用514.5 nm Ar+離子激光器，積分3 s，累積1次，采集 24張譜圖，所采集到的譜圖見圖3A。從圖可以看出，在該區(qū)域內(nèi)所獲得的24張譜圖峰高差異不大，所測區(qū)域內(nèi)每個點都能產(chǎn)生較為一致的增強效果。記錄每個檢測點上譜圖在1 436 cm-1處特征峰的強度(圖3B)，經(jīng)計算，這24個測量點峰強度的相對標準偏差(RSD)為5.9%，說明其SERS信號強度差異較小，基底具有較好的均勻性。

為了說明不同批次制備得到的SERS基底的重復性，對9個批次基底進行考察。以10-7mol/L PATP作為探針分子，每個批次隨機采集5張光譜，并計算其在1 436 cm-1處峰高的平均值。9個批次光譜的平均信號強度如圖4所示。經(jīng)計算，該9批基底上所采集到的信號值的RSD為7.5%，表明基底具有良好的批-批重復性，制備方法的重復性高。

圖3 SERS基底的點-點重復性

圖4 不同批次制備基底上采集到的10-7 mol/L PATP的信號強度(1 436 cm-1)

圖5 不同質(zhì)量濃度糖精鈉的SERS信號曲線

圖6 飲料樣品經(jīng)二維TLC展開后的照片(A)與薄層板上b點采集到的SERS光譜圖(B)

2.3 基底對不同質(zhì)量濃度糖精鈉標準溶液的響應

2.4 二維TLC-SERS聯(lián)用技術用于飲料及水果中糖精鈉的檢測

將二維TLC-SERS聯(lián)用技術用于實際樣本飲料和水果中糖精鈉的檢測。采用“1.4”前處理方法，飲料樣本經(jīng)過二維TLC展開后如圖6所示，圖中b點檢測到了糖精鈉的信號，其特征峰和標樣峰基本一致，可以確定糖精鈉的存在。記錄709 cm-1位置的峰強，并用上述線性方程計算，測得飲料中糖精鈉的質(zhì)量濃度為(141±11.2)mg/L。對于紅棗中糖精鈉的測定，采用“1.4”中水果的處理方法進行展開和計算，得到紅棗中糖精鈉的質(zhì)量濃度為(18±1.9)mg/L。為了驗證方法的準確性，采用液相色譜法進行了平行檢測，得到飲料和紅棗中糖精鈉的質(zhì)量濃度分別為(149±9.6)mg/L和(20±1.6)mg/L。本方法測得結果與色譜法基本一致，兩者的相對偏差(RD)分別為5.3%和10 %，說明本方法是一種可靠的快速分析方法。

3 結 論

本研究構建了一種二維TLC-SERS技術，采用納米金修飾的二氧化硅微球作為SERS基底，將第一次沒有分開的目標物成功從混合體系中分離，提高了色譜的分離能力,且靈敏度高。9個批次樣本基底SERS信號的RSD值為7.5%，表明基底的可重復性高，能夠可控制備。將該方法用于飲料和水果中糖精鈉的快速分析，所得結果與液相色譜方法的RD值在10%以內(nèi)。本方法操作簡單，有望應用于食品中農(nóng)殘和其他添加劑的快速分析。