崔鈺瑩，于欣楷，章 航，梁鵬宇,崔 鼎，徐 童，杜振霞*，謝云峰

(1.北京化工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院 營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209)

食品工業(yè)一直努力改善乳制品風(fēng)味，為消費(fèi)者提供多重選擇。乳品經(jīng)煮開(kāi)后自然發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵乳種類(lèi)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，更易被人體吸收利用[1-2]。然而，在熱處理過(guò)程中易發(fā)生一種普遍的非酶褐變現(xiàn)象(即美拉德反應(yīng))，該反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)和有毒化合物，并改變發(fā)酵乳的感官和功能特性[3]。炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳在發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間低溫烤制，使牛奶中的乳糖焦糖化，美拉德反應(yīng)充分，自然形成褐色酸奶，口感焦香濃郁[4-6]。美拉德反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的羥甲基糠醛(5-HMF)是衡量反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，其經(jīng)水解可產(chǎn)生糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙酰基呋喃(FMC)，是美拉德反應(yīng)的晚期產(chǎn)物[7]。據(jù)報(bào)道，此4種糠醛類(lèi)物質(zhì)均有不同程度的毒性，對(duì)人體健康具有潛在危害[8]。因此，發(fā)酵乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及質(zhì)量問(wèn)題備受消費(fèi)者和科研工作者關(guān)注。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道了很多用于分離分析牛乳、蜂蜜、調(diào)味品、飲料和酒類(lèi)中糠醛類(lèi)物質(zhì)的方法[9-15]，如劉暢等[16]采用HPLC法檢測(cè)褐色酸奶中5-羥甲基糠醛；林曉珊等[17]利用GC-MS/MS快速測(cè)定了調(diào)味品中3種糠醛類(lèi)物質(zhì)；孫瑤等[18]應(yīng)用一種基于氮酮形成的柱前熒光衍生化方法測(cè)定牛奶粉和葡萄干中的羥甲基糠醛、糠醛、甲基糠醛、2-乙酰基呋喃。然而，對(duì)發(fā)酵乳中上述4種糠醛類(lèi)物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了一種發(fā)酵乳中上述4種糠醛類(lèi)物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的GC-MS/MS方法，采用QuEChERS前處理技術(shù)[19-20]，有效降低了基質(zhì)干擾，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，是一種快速有效的檢測(cè)方法。通過(guò)該方法可判斷發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝對(duì)其糠醛危害物產(chǎn)生量的影響，進(jìn)而為消費(fèi)者提供合理的選購(gòu)建議與指導(dǎo)，具有一定的創(chuàng)新性和實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TQS8000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(賽默飛公司)，配RTX-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；MX-S渦旋振蕩器(萬(wàn)順儀器公司)；SB-3200DTDN超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RJ-2GL-1850臺(tái)式高速離心機(jī)(無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(安捷倫公司)。

羥甲基糠醛(5-HMF)、糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙?；秽?FMC)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司)；氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水硫酸鎂(分析純，國(guó)藥集團(tuán))；C18、PSA(Agela Technologies公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 mg 4種糠醛標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL甲醇(色譜純)溶液中，分別配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL單標(biāo)貯備液，-20 ℃保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用甲醇(色譜純)溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的4種糠醛的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.0 g(精確至0.000 1 g)樣品，加入2 mL乙腈、0.6 g氯化鈉(NaCl)和0.2 g無(wú)水乙酸鈉(NaAc)鹽析破乳，充分渦旋2 min，超聲20 min，再加入0.6 g無(wú)水MgSO4除水，放入高速冷凍離心機(jī)中以6 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入40 mg C18、10 mg PSA和100 mg無(wú)水MgSO4凈化，渦旋，靜置，過(guò)0.22 μm PTFE膜，濾液上機(jī)測(cè)試。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：色譜柱RTX-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣(He)，碰撞氣為氬氣(Ar)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，恒流模式，柱流量1 mL/min，升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。

三重四極桿質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源(EI)，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為300 ℃，電離能量為70 eV，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。4種糠醛類(lèi)化合物的保留時(shí)間、離子信息及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 4種糠醛類(lèi)化合物的保留時(shí)間、離子對(duì)以及碰撞能量

*quantitation ion pair

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1 mg/L 4種糠醛類(lèi)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測(cè)，采用全掃描確定各化合物的質(zhì)譜圖，再經(jīng)子離子掃描后，利用儀器配置的Trace Finder自動(dòng)優(yōu)化軟件，確定兩個(gè)子離子豐度較高時(shí)的碰撞電壓，得到各待測(cè)物的2組母離子->子離子對(duì)，即目標(biāo)化合物的定性和定量離子對(duì)，以響應(yīng)值較高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

基于化合物沸點(diǎn)及色譜柱使用范圍優(yōu)化色譜柱條件。由于目標(biāo)化合物具有醛、醚和酮官能團(tuán)，因此考察HP-5和RTX-WAX兩種極性色譜柱對(duì)糠醛化合物的分離效果。結(jié)果顯示，HP-5色譜柱存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，分離效率差；而RTX-WAX極性色譜柱具有尖峰和高分辨率。因此，選擇RTX-WAX色譜柱分離4種糠醛化合物。

圖1 4種糠醛類(lèi)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

在優(yōu)化條件下，F(xiàn)、FMC、MF、5-HMF得到了較好的分離，其混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

QuEChERS技術(shù)是本研究前處理的關(guān)鍵，為考慮多因素的綜合效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)選擇萃取試劑、鹽析劑用量、凈化劑用量3個(gè)因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素取2個(gè)水平，共8組實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次取平均值。實(shí)驗(yàn)的因素及水平條件選擇如下：以乙腈或含有0.1%乙酸的乙腈為萃取劑；0.6 g NaCl+0.2 g NaAc或0.4 g NaCl+0.4 g NaAc為鹽析劑；40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4或30 mg C18+20 mg PSA+100 mg MgSO4為凈化劑。結(jié)果顯示，選擇以乙腈為萃取劑，鹽析劑為0.6 g NaCl+0.2 g NaAc，凈化劑為40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4時(shí)，4種糠醛類(lèi)化合物回收率最優(yōu)，達(dá)到90.6%～122%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限配制4種糠醛類(lèi)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定，以各化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羥甲基糠醛在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.998。分別以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4種糠醛類(lèi)化合物的LODs為1.0～15 μg/kg,LOQs為3.0～45 μg/kg(表2)。

表2 復(fù)原乳基質(zhì)中4種糠醛化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、檢出限(LODs)及定量下限(LOQs)

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選擇某品牌原味發(fā)酵乳，在優(yōu)化條件下測(cè)定，得糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羥甲基糠醛的含量分別為0.038、0.022、0.010、0.093 mg/kg，再以其為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，4種糠醛化合物在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為82.2%～118%，RSD為0.74%～10%(表2)，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

采集市售相同生產(chǎn)日期的發(fā)酵乳(原味發(fā)酵乳5種，炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳6種)在優(yōu)化條件下檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4種糠醛化合物均有不同程度的檢出，F(xiàn)、FMC、MF、5-HMF檢出量分別為0.016～0.619、LOD～0.052、0.005～0.320、LOD～1.760 mg/kg，且5-HMF含量最高(表3)。其中樣品2和樣品6的色譜圖見(jiàn)圖2。

表3 11種發(fā)酵乳中4種糠醛類(lèi)危害物含量

NF：not found

圖2 實(shí)際樣品色譜圖

由表3可知，4種糠醛類(lèi)危害物在炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳中的含量明顯高于在原味發(fā)酵乳中，其中5-HMF含量高出近15倍。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵乳生產(chǎn)工藝中涉及原料乳進(jìn)行殺菌褐變(95 ℃,150 min)，經(jīng)一些系列過(guò)程后再自然冷卻發(fā)酵[21]，該處理過(guò)程中易產(chǎn)生相應(yīng)的美拉德反應(yīng)。炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳由鮮牛奶與糖經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱后得到，其中的糖(羥基化合物)與氨基酸(氨基化合物)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有特殊氣味的棕褐色物質(zhì)，美拉德反應(yīng)進(jìn)行更加徹底，導(dǎo)致糠醛類(lèi)危害物含量明顯增高，與實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，熱處理產(chǎn)生的糠醛類(lèi)物質(zhì)，對(duì)人體健康有一定影響;原味發(fā)酵乳中糠醛類(lèi)物質(zhì)含量更低，質(zhì)量更優(yōu)，從而可在兩種發(fā)酵乳的選購(gòu)上為消費(fèi)者提供參考依據(jù)。同時(shí)，炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵工藝復(fù)雜，成本高，建議乳制品工業(yè)在滿足風(fēng)味要求的基礎(chǔ)上，盡量減少熱處理，保證發(fā)酵乳品質(zhì)。

3 結(jié) 論

本文利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS技術(shù)，對(duì)發(fā)酵乳中4種糠醛類(lèi)化合物進(jìn)行了定性定量分析。該方法前處理操作簡(jiǎn)單快速，加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足要求，具有靈敏度高，檢出限低，準(zhǔn)確度好，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)原味發(fā)酵乳和炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳中的糠醛類(lèi)物質(zhì)含量的比較可間接評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣。結(jié)合發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝，探究了炭燒工藝技術(shù)對(duì)糠醛產(chǎn)生量的影響，進(jìn)而對(duì)消費(fèi)者合理選擇發(fā)酵乳提供建議與指導(dǎo)，同時(shí)建議乳制品工業(yè)生產(chǎn)盡量減少不必要的熱處理，保證發(fā)酵乳品質(zhì)。