林法喜，孫紅勇*

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

精子發(fā)生是一個(gè)細(xì)胞分化過(guò)程，高度有序，男性不育受到精子發(fā)生異常的直接而深刻的影響[1]?，F(xiàn)階段，對(duì)生精細(xì)胞分化進(jìn)行穩(wěn)定研究的細(xì)胞平臺(tái)仍然缺乏，在研究精子發(fā)生的過(guò)程中需要將特定類型的生精細(xì)胞從研究物種的睪丸中分離出來(lái)作為研究起始材料[2]。重力密度梯度沉降法能夠?qū)⑸?xì)胞分離出來(lái)，和二代測(cè)序技術(shù)有機(jī)結(jié)合將生精細(xì)胞特異的miRNA表達(dá)譜在鼠精子發(fā)生過(guò)程中的變化規(guī)律、4種生精細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜變化規(guī)律尋找了出來(lái)[3]。本文研究了重力密度梯度沉降法中生精細(xì)胞類型吖啶橙染色快速鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)買北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供的20只3周齡、10只5周齡SPF級(jí)ICR品系雄性小鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0010。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

購(gòu)買Sigma公司生產(chǎn)的花生凝集素（FITC標(biāo)記）、胰蛋白酶、膠原酶、DNAasel，Hyclone公司生產(chǎn)的1640培養(yǎng)基，羅氏公司生產(chǎn)的細(xì)胞核染料，BD Falcon公司生產(chǎn)的40μm細(xì)胞網(wǎng)篩。

1.3 方法

1.3.1 分離生精細(xì)胞

運(yùn)用重力密度梯度沉降法，粗線期從3周小鼠睪丸獲得精母細(xì)胞、長(zhǎng)形、圓形精子細(xì)胞。運(yùn)用頸椎脫臼法將小鼠處死，將睪丸取出來(lái)，將白膜剝?nèi)ァＳ眯〖舻都羲榍?xì)精管至漿糊狀，向50ml離心管中轉(zhuǎn)移，用Krebs溶液補(bǔ)到20～25ml，冰上進(jìn)行5min靜置，將上清棄去。將10μl 1g/L DNase I+10ml 1g/L膠原酶加入，在37℃溫度下進(jìn)行10min水浴振蕩，同時(shí)不時(shí)吹吸，在此過(guò)程中將吸管充分利用起來(lái)，消化生精小管為極小片段，鏡檢從生精上皮分離出大多數(shù)生精細(xì)胞，之后將30ml左右預(yù)冷的Krebs溶液加入，將消化終止。在4℃的溫度下進(jìn)行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去，將10μl 1g/L DNase I+5ml 1g/L胰蛋白酶加入，在37℃的溫度下進(jìn)行10min左右的水浴振蕩，同時(shí)不時(shí)用吸管吹吸，直到鏡檢視野中絕大多數(shù)為散在的單細(xì)胞，將30ml左右預(yù)冷的0.5% BSA/Krebs溶液加入，將消化終止。在4℃溫度下進(jìn)行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去。用0.5% BAS/Krebs洗細(xì)胞沉淀1次，在4℃溫度下進(jìn)行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去。最后懸起細(xì)胞沉淀，在此過(guò)程中將15～20ml 0.5%BSA/Krebs充分利用起來(lái)，同時(shí)經(jīng)40μm細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾。將細(xì)胞收集起來(lái)并編號(hào)，每管12ml左右，將150μl從每管中取出來(lái)，在96孔板中加入，將1.5μl 0.2g/L吖啶橙染液加入到每孔中，以輕柔的動(dòng)作拍打混勻。將細(xì)胞純度、類型確定下來(lái)，途徑為熒光倒置顯微鏡（Zeiss Axio Observer DI）下觀察，并將同類細(xì)胞合并。吖啶橙染色觀察：熒光通道鏡下細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)分別深染、淺染，分別呈綠色、淡黃色或橘黃色，具有較為清晰的染色背景、顯著的形態(tài)。但是拍攝出的圖片在相機(jī)的限制下只能區(qū)別細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的深染、淺染。

1.3.2 熒光染色

用PBS液洗滌生精細(xì)胞2次，每次在4℃溫度下進(jìn)行5min離心，將速率設(shè)定為2000r/min，之后向1.5ml離心管中轉(zhuǎn)移，用1ml PBS懸起，將20μl細(xì)胞懸液取出來(lái)涂片，自然晾干。室溫下將細(xì)胞涂片固定起來(lái)，在此過(guò)程中將4%多聚甲醛充分利用起來(lái)，0.5% Triton X-100透化，同時(shí)漂洗，在此過(guò)程中將PBS充分利用起來(lái)，將FITC/PNA染頂體20μg/ml加入，室溫下進(jìn)行40min左右的孵育，將DAPI染細(xì)胞核1μg/ml加入，室溫下進(jìn)行5min的孵育，漂洗過(guò)程中將PBS充分利用起來(lái)，封片觀察。

2 結(jié) 果

2.1 吖啶橙染色能夠?qū)⒑习w對(duì)生精細(xì)胞鑒定的干擾排除

吖啶橙染色能夠?qū)忡R下合胞體現(xiàn)象（兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞聚集形成）與圓形細(xì)胞進(jìn)行有效區(qū)分。

2.2 吖啶橙染色鑒定小鼠粗線期精母細(xì)胞

光鏡下粗線期精母細(xì)胞具有較大的直徑，為12～18μm，平均（15.2±2.3）μm，呈球形。吖啶橙染色結(jié)果表明，粗線期精母細(xì)胞較大，具有較多的核質(zhì)比、顯著的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.3 吖啶橙染色鑒定小鼠圓形精子細(xì)胞

光鏡下圓形精子細(xì)胞直徑為8～10μm，平均（9.1±1.2）μm，呈球形。吖啶橙染色結(jié)果表明，圓形精子具有較小的體積，在細(xì)胞中央或偏向細(xì)胞一側(cè)分布，細(xì)胞核為圓形。

2.4 吖啶橙染色鑒定小鼠長(zhǎng)形精子細(xì)胞

光鏡下長(zhǎng)形精子形變，具有各異的形態(tài)。吖啶橙染色結(jié)果表明，長(zhǎng)形精子細(xì)胞的細(xì)胞核形變，濃縮變小，通常呈顯著長(zhǎng)條形，具有極性。

2.5 3種生精細(xì)胞DAPI/PNA染色鑒定純度

熒光染色分離到的粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞的細(xì)胞核/頂體純度均為90%。

3 討 論

在重力密度梯度沉降法中，如何將高純度的生精細(xì)胞獲取過(guò)來(lái)是一個(gè)技術(shù)難題，而對(duì)分離到的生精細(xì)胞純度來(lái)說(shuō)，鏡檢沉降后分離出的各管細(xì)胞組分發(fā)揮著極為重要的作用[4]。本研究改進(jìn)了鏡檢方法，用吖啶橙熒光染色收集到的每管細(xì)胞，只需要在96孔板中加入吖啶橙染液就能夠觀察，不需要額外處理細(xì)胞，和細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)形態(tài)檢測(cè)中細(xì)胞大小形態(tài)檢測(cè)中直接光鏡下觀察相比具有較短的檢測(cè)時(shí)間、較為簡(jiǎn)便的操作，能夠?qū)㈤L(zhǎng)形、圓形精子細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞精確、快速鏡檢出來(lái)，從而促進(jìn)生精細(xì)胞得量、純度的有效提升。本研究結(jié)果表明，吖啶橙染色能夠?qū)忡R下合胞體現(xiàn)象（兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞聚集形成）與圓形細(xì)胞進(jìn)行有效區(qū)分。光鏡下粗線期精母細(xì)胞呈球形，具有較大的直徑。粗線期精母細(xì)胞較大，具有顯著的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、較多的核質(zhì)比。光鏡下圓形精子細(xì)胞呈球形。圓形精子具有較小的體積，在細(xì)胞中央或偏向細(xì)胞一側(cè)分布，細(xì)胞核為圓形。光鏡下長(zhǎng)形精子形變，具有各異的形態(tài)。長(zhǎng)形精子細(xì)胞的細(xì)胞核形變，濃縮變小，通常呈顯著長(zhǎng)條形，具有極性。熒光染色分離到的長(zhǎng)形精子細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞的細(xì)胞核/頂體純度均為90%，充分證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述，重力密度梯度沉降法中生精細(xì)胞類型吖啶橙染色快速鑒定的效果好，值得推廣應(yīng)用。