［摘 要］ 目的：探討硫唑嘌呤（AZA）對(duì)還原型谷胱甘肽（GSH）過氧化物酶4抑制劑RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞鐵死亡的影響，并闡明其可能的作用機(jī)制。方法：小鼠精母GC-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（不進(jìn)行處理）、RSL3 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h）、RSL3+鐵死亡抑制劑（Fer-1） 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h）、RSL3+低劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h）、RSL3+ 中劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h） 和RSL3+高劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h）。MTT 法檢測(cè)不同濃度AZA 和不同濃度RSL3 作用后GC-2 細(xì)胞活性，采用GSH 和氧化型谷胱甘肽（GSSG） 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GC-2 細(xì)胞中GSH 和GSSG 水平，采用丙二醛（MDA） 試劑盒檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平，采用Western blotting 法檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞中長(zhǎng)鏈脂酰CoA 合成酶4 （ACSL4）、血紅素氧合酶1 （HO-1） 和谷胱甘肽過氧化物酶4 （GPX4） 蛋白表達(dá)水平，采用免疫熒光法檢測(cè)各組GC-2細(xì)胞中ACSL4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，5、10和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細(xì)胞細(xì)胞活力明顯降低（Plt;0. 01），因此AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。與對(duì)照組比較，1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），50、100、500 和1 000 nmol·L-1RSL3 組GC-2 細(xì)胞活性明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），因此將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1 以內(nèi)。GSH 和MDA 試劑盒檢測(cè)，與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中GSSG 和MDA 水平明顯升高（Plt;0. 05）， GSH 水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較， RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GSSG 和MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）， GSH 水平明顯升高（Plt;0. 01）。Westernblotting 法檢測(cè)， 與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與RSL3 組比較，RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。免疫熒光檢測(cè)，與對(duì)照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量明顯增多；與RSL3組比較，RSL3+Fer-1組和RSL3+AZA組ACSL4蛋白表達(dá)量明顯降低。結(jié)論：AZA可以減輕RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞鐵死亡。

［關(guān)鍵詞］ 硫唑嘌呤； 鐵死亡； 精母細(xì)胞； 谷胱甘肽過氧化物酶4； 酯酰輔酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4

［中圖分類號(hào)］ R332； R285. 5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A[文章編號(hào)] 1671?587X（2024）05?1217?10

男性不育是現(xiàn)代社會(huì)一大醫(yī)療挑戰(zhàn)，其病因繁多，包括但不限于精液質(zhì)量異常、精子生成過程障礙和精子與卵子結(jié)合障礙等。質(zhì)量良好的精子對(duì)于生殖成功至關(guān)重要［1-2］。研究［3-5］ 顯示： 精子在遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí)，其動(dòng)力學(xué)特性受到負(fù)面影響，表現(xiàn)為活力下降和畸形率升高，上述變化往往導(dǎo)致男性不育。鐵死亡是一種由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡模式， 其特征是還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 枯竭和谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathioneperoxidase 4，GPX4） 活性降低，導(dǎo)致身體無(wú)法有效清除脂質(zhì)過氧自由基，從而觸發(fā)含鐵生物分子氧化，終致細(xì)胞死亡［6-7］。GPX4 抑制劑RSL3 可誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，在許多研究［8］ 中用作鐵死亡誘導(dǎo)劑。硫唑嘌呤（azathioprine，AZA） 是臨床上廣泛應(yīng)用的免疫抑制藥物，在體內(nèi)代謝成巰嘌呤發(fā)揮免疫抑制效果，能緩解炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激［9-10］。目前AZA 是否具有調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡的潛力，尤其在改善男性不育方面的作用尚不明確。本研究旨在探討AZA 能否減輕RSL3 誘導(dǎo)的精母細(xì)胞的鐵死亡效應(yīng)， 闡明AZA 治療男性不育的潛在作用機(jī)制，為尋找治療男性不育的新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠精母 GC-2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心（American TypeCulture Collection，ATCC）。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， GPX4、酯酰輔酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4 （acyl CoAsynthetase long-chain family member 4， ACSL4）、血紅素氧合酶1 （heme oxygenase-1 ， HO-1）和β 微管蛋白（β-tubulin） 均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司， GSH 和氧化型谷胱甘肽（glutathioneoxidized，GSSG） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司， BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，抗熒光淬滅劑購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司， 山羊抗兔紅色熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch 公司， 4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Centrifuge5804R 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司，F(xiàn)luor Chem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Protein Simple 公司， Synergy H1 多功能酶熒光標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司， NIS-Elements 激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本尼康株式會(huì)社。

1. 2 小鼠精母 GC-2細(xì)胞分組和培養(yǎng)方法 小鼠GC-2 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清和青-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eaglemedium，DMEM），置于37 ℃、5% CO2 的恒溫細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC-2 細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，隨機(jī)分為對(duì)照組（不進(jìn)行處理）、RSL3 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h）、RSL3+鐵死亡抑制劑（Ferrostatin-1， Fer-1） 組（給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h +2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h）、RSL3+低劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h）、RSL3+中劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h） 和RSL3+ 高劑量AZA 組（ 給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h）。

1. 3 MTT 法 檢 測(cè) 不 同 濃 度 AZA 作 用 后 各 組GC-2 細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2細(xì)胞，以每孔5×104 個(gè)的密度接種至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔加入500 μL DMEM， 置于恒溫孵箱培育24 h。細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度AZA 組， 吸棄細(xì)胞上清，加入含不同濃度AZA 的培養(yǎng)基，使AZA 終濃度達(dá)到0、5、10、20、30 和40 μmol·L-1。12 h 后向24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，置于恒溫孵箱中孵育4 h，輕輕吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清， 每孔加入400 μL 二甲亞砜（dimethylsulfoxide， DMSO） 溶液， 將24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于搖床避光振蕩10 min， 采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 和630 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A） 值。細(xì)胞活性=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值） / （對(duì)照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 4 MTT 法檢測(cè)不同濃度 RSL3 作用后 GC-2細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 GC-2細(xì)胞，以每孔 5×104 個(gè)的密度接種至 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔加入500 μL DMEM， 置于恒溫孵箱培育24 h。細(xì)胞對(duì)照組和不同濃度RSL3 組，吸棄培養(yǎng)上清后，向各組細(xì)胞中分別加入含不同濃度RSL3 （0、1、5、10、500 和1 000 nmol·L-1） 的DMEM。MTT 法檢測(cè)見“1. 3”。

1. 5 各組GC-2細(xì)胞中蛋白含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2 細(xì)胞，以每孔4×105 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 按照“1. 2” 中方法分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。采用1 mL 預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffer saline，PBS） 洗滌細(xì)胞3 次，離心5 min 后收集細(xì)胞沉淀。加入50 μL 蛋白去除劑，振蕩重懸細(xì)胞， 將重懸的細(xì)胞在超低溫液氮和37 ℃水浴條件下反復(fù)凍融3 次。置于冰上5 min 后，離心10 min，取樣品上清用于GSH 和GSSG 含量檢測(cè)。另取部分上清加入1×GSH 清除緩沖液和1×GSH 清除工作液震蕩混勻，用于GSSG 含量檢測(cè)。樣品加入總谷胱甘肽檢測(cè)工作液混勻，室溫孵育5 min，加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（triphosphopyridinenucleotide，NADPH） 溶液50 μL 混勻， 25 min 后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm 波長(zhǎng)處A 值。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic cacid，BCA） 法檢測(cè)各組細(xì)胞中目的蛋白含量， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總谷胱甘肽（即GSH+GSSG） 和GSSG 含量。GSH 含量=（總谷胱甘肽含量-GSSG 含量） ×2。

1. 6 各組GC-2細(xì)胞中MDA水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2 細(xì)胞， 以每孔4×105 個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照“1. 2”中方法分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄培養(yǎng)上清， 采用預(yù)冷的PBS 緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3 次， 吸棄PBS 緩沖液， 每孔加入200 μL 裂解液， 將樣品置于冰上搖床振蕩裂解30 min， 采用BCA 試劑盒檢測(cè)樣品的蛋白濃度；取100 μL 充分裂解的樣品加入200 μL MDA 檢測(cè)工作液后充分振蕩混勻。將混合均勻的樣品置于100 ℃ 沸水浴中加熱 15 min， 水浴冷卻至室溫后， 離心10 min取上清液， 采用酶標(biāo)儀在532 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A 值， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組GC-2 細(xì)胞中MDA水平。

1. 7 Western blotting 法 檢 測(cè) 各 組 GC-2 細(xì) 胞 中GPX4、ACLS4 和 HO-1 蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC-2 細(xì)胞，以每孔4×105 個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 按照“1. 2” 中方法分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組， 每孔加入200 μL 裂解液， 將樣品置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000 g 離心15 min，取樣本上清，采用BCA 法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。采用12. 5% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）凝膠電泳分離蛋白，于冰水中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF） 膜。將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中封閉1 h，室溫孵育ACSL4、GPX4、HO-1 和β - 微管蛋白抗體2 h。Westernblotting 洗脫緩沖液（Tris-buffered saline andTween 20， TBST） 洗膜3 次后加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h， TBST 洗膜3 次， 采用化學(xué)發(fā)光底物（electrochemiluminescence， ECL） 顯影液顯影。采用Image J 軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)水平= 目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-tubulin 蛋白條帶灰度值。

1. 8 免疫熒光法檢測(cè)各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 GC-2細(xì)胞，以每孔 1×105 個(gè)的密度接種于提前放置爬片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜， 按照“1. 2” 中方法分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄上清，每孔采用1 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次。吸棄PBS 緩沖液，每孔加入4% 多聚甲醛1 mL， 固定30 min 后采用真空吸液泵吸棄多聚甲醛。采用0. 5% Triton-X 100 通透10 min， PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min。在爬片上滴加免疫封閉液， 室溫封閉1 h， 吸棄封閉液， 將配置好的ACSL4 一抗工作液滴加至染色區(qū)域， 置于濕盒中4 ℃ 過夜。次日回收一抗， PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。避光加入相應(yīng)熒光二抗，置于濕盒中室溫孵育1 h。吸棄二抗， PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。加入DAPI 孵育10 min， PBS 緩沖液洗滌3 次。加入抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，定性檢測(cè)細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組GC-2 細(xì)胞活性， 各組GC-2 細(xì)胞中GSH、GSSG 和MDA 水平， 各組GC-2 細(xì)胞中GPX4、ACSL4、HO-1 和ACSL4 蛋白表達(dá)水平以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度 AZA 處理后各組 GC-2 細(xì)胞活性 與對(duì)照組比較， 5、10 和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細(xì)胞活性明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。因此，本研究中AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。

2. 2 不同濃度 RSL3 處理后各組 GC-2 細(xì)胞活性 與對(duì)照組比較， 1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組細(xì)胞活性明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表2。因此， 本研究將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1以內(nèi)。

2. 3 各組 GC-2細(xì)胞中 GSH 和 GSSG水平 與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中GSH 水平降低（Plt;0. 05）， GSSG 水平升高（Plt;0. 05）， GSH/GSSG 比值降低（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較，RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GSH 水平升高（Plt;0. 01），GSSG 水平降低（Plt;0. 01），GSH/GSSG比值升高（Plt;0. 05）。見表3。

2. 4 各組 GC-2 細(xì)胞中 MDA 水平 與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平升高（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較， RSL3+Fer-1 組和RSL3+不同濃度AZA 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平降低（Plt;0. 01）。見表4。

2. 5 各 組 GC-2 細(xì) 胞 中 GPX4、 ACLS4 和 HO-1蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，RSL3組GC-2細(xì)胞中ACSL4和HO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01），GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與 RSL3 組 比 較， RSL3+Fer-1 組 和RSL3+ 不同濃度AZA 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1 和表5。

2. 6 各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白表達(dá)量 與對(duì)照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量 增 多； 與 RSL3 組 比 較， RSL3+Fer-1 組 和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量明顯降低。見圖2。

3 討 論

男性不育問題在全球范圍內(nèi)逐年加劇，對(duì)個(gè)人和家庭健康構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。不育癥的成因多樣，包括遺傳、環(huán)境和生活習(xí)慣等［11-13］。在臨床上，精子的數(shù)量、活動(dòng)力和形態(tài)是評(píng)估男性不育的關(guān)鍵生物學(xué)指標(biāo)［11-13］。精子的生成和成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程： 精原細(xì)胞的增殖并分化為精母細(xì)胞， 精母細(xì)胞經(jīng)過2 次減數(shù)分裂形成精子細(xì)胞， 最后經(jīng)過細(xì)胞變態(tài)的過程形成成熟的精子。該過程需要細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和精確的分子調(diào)控，任何對(duì)上述過程的干擾都可能導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，進(jìn)而影響男性的生育能力［14-15］。研究 ［16］ 顯示：精母細(xì)胞異常，包括染色體異常、染色體非整倍體、DNA 損傷、基因突變、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的異常等都可能導(dǎo)致精子發(fā)育過程受損。因此，本研究采用GC-2 細(xì)胞作為模型， 探討精母細(xì)胞異常對(duì)于男性不育防治的意義。

鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種新形式，與男性不育有密切關(guān)聯(lián)［17-18］。鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化引發(fā)的細(xì)胞死亡途徑，在精子形成中起重要調(diào)控作用。異常鐵死亡過程可能導(dǎo)致睪丸組織和精子的氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響精子的形成和成熟［19］。研究 ［20］ 顯示：PM2. 5 等導(dǎo)致的男性生殖系統(tǒng)損傷與精母細(xì)胞鐵死亡有密切關(guān)聯(lián)。鐵死亡誘導(dǎo)劑包括以下幾類：抑制Xc 系統(tǒng)活性， 如erastin 和柳氮磺砒啶； 抑制或降解GPX4， 如RSL3 和FIN56； 消耗輔酶Q10，如他汀類藥物；通過鐵過載或多不飽和脂肪酸過載誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，如血紅素及FINO2［21］。本研究中， 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 作用GC-2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞中GSH 水平降低，MDA 水平升高，鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 表達(dá)水平降低，ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平升高， 表明RSL3 可以誘導(dǎo)GC-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。GC-2 細(xì)胞經(jīng)鐵死亡抑制劑Fer-1 處理后，細(xì)胞中GSH 水平有所升高，MDA 水平得到恢復(fù)， 進(jìn)一步證實(shí)鐵死亡與精母細(xì)胞損傷有密切關(guān)聯(lián)。因此， 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 作用的GC-2 細(xì)胞可作為細(xì)胞模型進(jìn)一步探討防治精母細(xì)胞鐵死亡的藥物。

鐵死亡過程中，GPX4 能有效清除脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)精子免受氧化損傷［22-23］。GPX4 是一種硒蛋白，可作為GSH 依賴的過氧化物酶清除脂質(zhì)過氧化物而保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化，當(dāng)GSH 合成受阻或者GSH 依賴性的GPX4 在體內(nèi)被抑制時(shí)，便會(huì)觸發(fā)鐵死亡。在生殖系統(tǒng)中，GPX4 在生殖器官和精子中大量表達(dá)，30% 不育男性精子中GPX4表達(dá)水平降低［24］。GPX4 活性喪失或低表達(dá)已被證實(shí)與精子畸形率增高和生育能力下降有關(guān)［25-26］。ACSL4 是一種將CoA 酯化為特定多不飽和脂肪酸（花生四烯酸和腎上腺酸） 的酶［27］。ACSL4 和GPX4 分別正向和負(fù)向調(diào)節(jié)鐵死亡［28］。HO-1 可以通過釋放血紅素中的鐵來(lái)升高細(xì)胞中鐵離子濃度，鐵離子過量可能會(huì)促進(jìn)泛素化脂質(zhì)過氧化物酶的形成，破壞細(xì)胞膜完整性，最終引發(fā)鐵死亡。在雄性生殖系統(tǒng)，HO-1 有助于抑制精子和睪丸組織中活性氧的過量積累， 從而保護(hù)精子的功能和完整性［26， 29-31］。上述研究提示： 鐵死亡標(biāo)志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 與雄性生殖損有傷密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示： 10 nmol·L-1 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 處理的GC-2 細(xì)胞中GPX-4 表達(dá)水平降低，HO-1 和ACSL4 表達(dá)水平升高， 而10 nmol·L-1RSL3 并未對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯影響，提示鐵死亡標(biāo)志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 表達(dá)水平的變化較細(xì)胞活性變化更為敏感，可作為精母細(xì)胞損傷敏感標(biāo)志分子。

AZA 作用機(jī)制包括其在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閹€嘌呤，從而抑制細(xì)胞增殖，主要用于治療各種炎癥性和自身免疫性疾?。?2-33］。此外，AZA 也展現(xiàn)了抗氧化應(yīng)激的潛力，可能通過影響抗氧化酶的表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞中GSH 水平來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害［34-35］。鐵死亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞中鐵離子釋放到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性和完整性受損［36］。因此， 鐵死亡與氧化應(yīng)激有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示： AZA 能降低RSL3 誘導(dǎo)的精母細(xì)胞氧化相關(guān)分子MDA 水平，提升抗氧化分子GSH 水平，證實(shí)AZA 抗氧化應(yīng)激的能力；同時(shí)AZA 還可以升高鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 表達(dá)水平且降低ACSL4 和HO-1 表達(dá)水平， 提示AZA 可作為鐵死亡相關(guān)的潛在治療劑，在防治精母細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮作用，該結(jié)果為研究和治療男性不育提供了新的思路。

綜上所述， AZA 通過對(duì)鐵死亡標(biāo)志分子和MDA 及GSH 等氧化抗氧化相關(guān)分子的調(diào)節(jié)，能夠有效減緩精母細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程，從而發(fā)揮對(duì)雄性不育的防治作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：葉嚴(yán)玨參與選題、實(shí)驗(yàn)操作過程、數(shù)據(jù)收集整理和論文撰寫，湯子怡、陽(yáng)詩(shī)盈和譚鈺培參與論文中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，劉永和尹俐參與指導(dǎo)論文撰寫。

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