[摘 要] 目的:探討硫唑嘌呤(AZA)對還原型谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶4抑制劑RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞鐵死亡的影響,并闡明其可能的作用機(jī)制。方法:小鼠精母GC-2細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(不進(jìn)行處理)、RSL3 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h)、RSL3+鐵死亡抑制劑(Fer-1) 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h)、RSL3+低劑量AZA 組(給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h)、RSL3+ 中劑量AZA 組(給予10 nmol·L-1 RSL3處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h) 和RSL3+高劑量AZA 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h)。MTT 法檢測不同濃度AZA 和不同濃度RSL3 作用后GC-2 細(xì)胞活性,采用GSH 和氧化型谷胱甘肽(GSSG) 檢測試劑盒檢測GC-2 細(xì)胞中GSH 和GSSG 水平,采用丙二醛(MDA) 試劑盒檢測各組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平,采用Western blotting 法檢測各組GC-2 細(xì)胞中長鏈脂酰CoA 合成酶4 (ACSL4)、血紅素氧合酶1 (HO-1) 和谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4) 蛋白表達(dá)水平,采用免疫熒光法檢測各組GC-2細(xì)胞中ACSL4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:與對照組比較,5、10和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0. 05),30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細(xì)胞細(xì)胞活力明顯降低(Plt;0. 01),因此AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。與對照組比較,1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0. 05),50、100、500 和1 000 nmol·L-1RSL3 組GC-2 細(xì)胞活性明顯降低(Plt;0. 05 或Plt;0. 01),因此將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1 以內(nèi)。GSH 和MDA 試劑盒檢測,與對照組比較, RSL3 組GC-2 細(xì)胞中GSSG 和MDA 水平明顯升高(Plt;0. 05), GSH 水平明顯降低(Plt;0. 05); 與RSL3 組比較, RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GSSG 和MDA 水平明顯降低(Plt;0. 01), GSH 水平明顯升高(Plt;0. 01)。Westernblotting 法檢測, 與對照組比較, RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高(Plt;0. 05),GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低(Plt;0. 01);與RSL3 組比較,RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯升高(Plt;0. 05),ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低(Plt;0. 01)。免疫熒光檢測,與對照組比較,RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量明顯增多;與RSL3組比較,RSL3+Fer-1組和RSL3+AZA組ACSL4蛋白表達(dá)量明顯降低。結(jié)論:AZA可以減輕RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞鐵死亡。
[關(guān)鍵詞] 硫唑嘌呤; 鐵死亡; 精母細(xì)胞; 谷胱甘肽過氧化物酶4; 酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4
[中圖分類號(hào)] R332; R285. 5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號(hào)] 1671?587X(2024)05?1217?10
男性不育是現(xiàn)代社會(huì)一大醫(yī)療挑戰(zhàn),其病因繁多,包括但不限于精液質(zhì)量異常、精子生成過程障礙和精子與卵子結(jié)合障礙等。質(zhì)量良好的精子對于生殖成功至關(guān)重要[1-2]。研究[3-5] 顯示: 精子在遭受氧化應(yīng)激損傷時(shí),其動(dòng)力學(xué)特性受到負(fù)面影響,表現(xiàn)為活力下降和畸形率升高,上述變化往往導(dǎo)致男性不育。鐵死亡是一種由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡模式, 其特征是還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH) 枯竭和谷胱甘肽過氧化物酶4 (glutathioneperoxidase 4,GPX4) 活性降低,導(dǎo)致身體無法有效清除脂質(zhì)過氧自由基,從而觸發(fā)含鐵生物分子氧化,終致細(xì)胞死亡[6-7]。GPX4 抑制劑RSL3 可誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡,在許多研究[8] 中用作鐵死亡誘導(dǎo)劑。硫唑嘌呤(azathioprine,AZA) 是臨床上廣泛應(yīng)用的免疫抑制藥物,在體內(nèi)代謝成巰嘌呤發(fā)揮免疫抑制效果,能緩解炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激[9-10]。目前AZA 是否具有調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡的潛力,尤其在改善男性不育方面的作用尚不明確。本研究旨在探討AZA 能否減輕RSL3 誘導(dǎo)的精母細(xì)胞的鐵死亡效應(yīng), 闡明AZA 治療男性不育的潛在作用機(jī)制,為尋找治療男性不育的新策略提供依據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠精母 GC-2細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司, GPX4、酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 (acyl CoAsynthetase long-chain family member 4, ACSL4)、血紅素氧合酶1 (heme oxygenase-1 , HO-1)和β 微管蛋白(β-tubulin) 均購自美國Proteintech公司, GSH 和氧化型谷胱甘肽(glutathioneoxidized,GSSG) 檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司, BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,抗熒光淬滅劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司, 山羊抗兔紅色熒光二抗購自美國Jackson ImmunoResearch 公司, 4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Centrifuge5804R 高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司,F(xiàn)luor Chem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Protein Simple 公司, Synergy H1 多功能酶熒光標(biāo)儀購自美國BioTek 公司, NIS-Elements 激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康株式會(huì)社。
1. 2 小鼠精母 GC-2細(xì)胞分組和培養(yǎng)方法 小鼠GC-2 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清和青-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eaglemedium,DMEM),置于37 ℃、5% CO2 的恒溫細(xì)胞孵箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的GC-2 細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn),隨機(jī)分為對照組(不進(jìn)行處理)、RSL3 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h)、RSL3+鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1, Fer-1) 組(給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h +2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h)、RSL3+低劑量AZA 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h)、RSL3+中劑量AZA 組(給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h) 和RSL3+ 高劑量AZA 組( 給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h)。
1. 3 MTT 法 檢 測 不 同 濃 度 AZA 作 用 后 各 組GC-2 細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期GC-2細(xì)胞,以每孔5×104 個(gè)的密度接種至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔加入500 μL DMEM, 置于恒溫孵箱培育24 h。細(xì)胞分為對照組和不同濃度AZA 組, 吸棄細(xì)胞上清,加入含不同濃度AZA 的培養(yǎng)基,使AZA 終濃度達(dá)到0、5、10、20、30 和40 μmol·L-1。12 h 后向24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL,置于恒溫孵箱中孵育4 h,輕輕吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清, 每孔加入400 μL 二甲亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO) 溶液, 將24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于搖床避光振蕩10 min, 采用酶標(biāo)儀檢測各孔在570 和630 nm 波長處的吸光度(A) 值。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A 值) / (對照組A 值-空白組A 值) ×100%。
1. 4 MTT 法檢測不同濃度 RSL3 作用后 GC-2細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期 GC-2細(xì)胞,以每孔 5×104 個(gè)的密度接種至 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔加入500 μL DMEM, 置于恒溫孵箱培育24 h。細(xì)胞對照組和不同濃度RSL3 組,吸棄培養(yǎng)上清后,向各組細(xì)胞中分別加入含不同濃度RSL3 (0、1、5、10、500 和1 000 nmol·L-1) 的DMEM。MTT 法檢測見“1. 3”。
1. 5 各組GC-2細(xì)胞中蛋白含量檢測 取對數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞,以每孔4×105 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。采用1 mL 預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffer saline,PBS) 洗滌細(xì)胞3 次,離心5 min 后收集細(xì)胞沉淀。加入50 μL 蛋白去除劑,振蕩重懸細(xì)胞, 將重懸的細(xì)胞在超低溫液氮和37 ℃水浴條件下反復(fù)凍融3 次。置于冰上5 min 后,離心10 min,取樣品上清用于GSH 和GSSG 含量檢測。另取部分上清加入1×GSH 清除緩沖液和1×GSH 清除工作液震蕩混勻,用于GSSG 含量檢測。樣品加入總谷胱甘肽檢測工作液混勻,室溫孵育5 min,加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(triphosphopyridinenucleotide,NADPH) 溶液50 μL 混勻, 25 min 后采用酶標(biāo)儀檢測412 nm 波長處A 值。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic cacid,BCA) 法檢測各組細(xì)胞中目的蛋白含量, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總谷胱甘肽(即GSH+GSSG) 和GSSG 含量。GSH 含量=(總谷胱甘肽含量-GSSG 含量) ×2。
1. 6 各組GC-2細(xì)胞中MDA水平檢測 取對數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞, 以每孔4×105 個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按照“1. 2”中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄培養(yǎng)上清, 采用預(yù)冷的PBS 緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3 次, 吸棄PBS 緩沖液, 每孔加入200 μL 裂解液, 將樣品置于冰上搖床振蕩裂解30 min, 采用BCA 試劑盒檢測樣品的蛋白濃度;取100 μL 充分裂解的樣品加入200 μL MDA 檢測工作液后充分振蕩混勻。將混合均勻的樣品置于100 ℃ 沸水浴中加熱 15 min, 水浴冷卻至室溫后, 離心10 min取上清液, 采用酶標(biāo)儀在532 nm 波長處測定各孔A 值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組GC-2 細(xì)胞中MDA水平。
1. 7 Western blotting 法 檢 測 各 組 GC-2 細(xì) 胞 中GPX4、ACLS4 和 HO-1 蛋白表達(dá)水平 取對數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞,以每孔4×105 個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組, 每孔加入200 μL 裂解液, 將樣品置于冰上充分裂解30 min,4 ℃、12 000 g 離心15 min,取樣本上清,采用BCA 法測定蛋白表達(dá)水平。采用12. 5% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)凝膠電泳分離蛋白,于冰水中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF) 膜。將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中封閉1 h,室溫孵育ACSL4、GPX4、HO-1 和β - 微管蛋白抗體2 h。Westernblotting 洗脫緩沖液(Tris-buffered saline andTween 20, TBST) 洗膜3 次后加入相應(yīng)二抗,37 ℃孵育1 h, TBST 洗膜3 次, 采用化學(xué)發(fā)光底物(electrochemiluminescence, ECL) 顯影液顯影。采用Image J 軟件檢測蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)水平= 目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-tubulin 蛋白條帶灰度值。
1. 8 免疫熒光法檢測各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白表達(dá)量 取對數(shù)生長期 GC-2細(xì)胞,以每孔 1×105 個(gè)的密度接種于提前放置爬片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜, 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄上清,每孔采用1 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次。吸棄PBS 緩沖液,每孔加入4% 多聚甲醛1 mL, 固定30 min 后采用真空吸液泵吸棄多聚甲醛。采用0. 5% Triton-X 100 通透10 min, PBS 緩沖液洗滌3 次, 每次5 min。在爬片上滴加免疫封閉液, 室溫封閉1 h, 吸棄封閉液, 將配置好的ACSL4 一抗工作液滴加至染色區(qū)域, 置于濕盒中4 ℃ 過夜。次日回收一抗, PBS 緩沖液洗滌3 次,每次5 min。避光加入相應(yīng)熒光二抗,置于濕盒中室溫孵育1 h。吸棄二抗, PBS 緩沖液洗滌3 次,每次5 min。加入DAPI 孵育10 min, PBS 緩沖液洗滌3 次。加入抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,定性檢測細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量。
1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組GC-2 細(xì)胞活性, 各組GC-2 細(xì)胞中GSH、GSSG 和MDA 水平, 各組GC-2 細(xì)胞中GPX4、ACSL4、HO-1 和ACSL4 蛋白表達(dá)水平以x±s 表示, 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析, 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2. 1 不同濃度 AZA 處理后各組 GC-2 細(xì)胞活性 與對照組比較, 5、10 和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0. 05),30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細(xì)胞活性明顯降低(Plt;0. 01)。見表1。因此,本研究中AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。
2. 2 不同濃度 RSL3 處理后各組 GC-2 細(xì)胞活性 與對照組比較, 1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0. 05), 50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組細(xì)胞活性明顯降低(Plt;0. 05 或Plt;0. 01)。見表2。因此, 本研究將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1以內(nèi)。
2. 3 各組 GC-2細(xì)胞中 GSH 和 GSSG水平 與對照組比較, RSL3 組GC-2 細(xì)胞中GSH 水平降低(Plt;0. 05), GSSG 水平升高(Plt;0. 05), GSH/GSSG 比值降低(Plt;0. 05); 與RSL3 組比較,RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中GSH 水平升高(Plt;0. 01),GSSG 水平降低(Plt;0. 01),GSH/GSSG比值升高(Plt;0. 05)。見表3。
2. 4 各組 GC-2 細(xì)胞中 MDA 水平 與對照組比較, RSL3 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平升高(Plt;0. 05); 與RSL3 組比較, RSL3+Fer-1 組和RSL3+不同濃度AZA 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平降低(Plt;0. 01)。見表4。
2. 5 各 組 GC-2 細(xì) 胞 中 GPX4、 ACLS4 和 HO-1蛋白表達(dá)水平 與對照組比較,RSL3組GC-2細(xì)胞中ACSL4和HO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(Plt;0. 05或Plt;0. 01),GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯降低(Plt;0. 05); 與 RSL3 組 比 較, RSL3+Fer-1 組 和RSL3+ 不同濃度AZA 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低(Plt;0. 05 或Plt;0. 01),GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯升高(Plt;0. 05)。見圖1 和表5。
2. 6 各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白表達(dá)量 與對照組比較,RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量 增 多; 與 RSL3 組 比 較, RSL3+Fer-1 組 和RSL3+AZA 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白表達(dá)量明顯降低。見圖2。
3 討 論
男性不育問題在全球范圍內(nèi)逐年加劇,對個(gè)人和家庭健康構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。不育癥的成因多樣,包括遺傳、環(huán)境和生活習(xí)慣等[11-13]。在臨床上,精子的數(shù)量、活動(dòng)力和形態(tài)是評估男性不育的關(guān)鍵生物學(xué)指標(biāo)[11-13]。精子的生成和成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程: 精原細(xì)胞的增殖并分化為精母細(xì)胞, 精母細(xì)胞經(jīng)過2 次減數(shù)分裂形成精子細(xì)胞, 最后經(jīng)過細(xì)胞變態(tài)的過程形成成熟的精子。該過程需要細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和精確的分子調(diào)控,任何對上述過程的干擾都可能導(dǎo)致精子質(zhì)量下降,進(jìn)而影響男性的生育能力[14-15]。研究 [16] 顯示:精母細(xì)胞異常,包括染色體異常、染色體非整倍體、DNA 損傷、基因突變、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的異常等都可能導(dǎo)致精子發(fā)育過程受損。因此,本研究采用GC-2 細(xì)胞作為模型, 探討精母細(xì)胞異常對于男性不育防治的意義。
鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種新形式,與男性不育有密切關(guān)聯(lián)[17-18]。鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化引發(fā)的細(xì)胞死亡途徑,在精子形成中起重要調(diào)控作用。異常鐵死亡過程可能導(dǎo)致睪丸組織和精子的氧化應(yīng)激,進(jìn)而影響精子的形成和成熟[19]。研究 [20] 顯示:PM2. 5 等導(dǎo)致的男性生殖系統(tǒng)損傷與精母細(xì)胞鐵死亡有密切關(guān)聯(lián)。鐵死亡誘導(dǎo)劑包括以下幾類:抑制Xc 系統(tǒng)活性, 如erastin 和柳氮磺砒啶; 抑制或降解GPX4, 如RSL3 和FIN56; 消耗輔酶Q10,如他汀類藥物;通過鐵過載或多不飽和脂肪酸過載誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化,如血紅素及FINO2[21]。本研究中, 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 作用GC-2 細(xì)胞24 h 后,細(xì)胞中GSH 水平降低,MDA 水平升高,鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 表達(dá)水平降低,ACSL4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平升高, 表明RSL3 可以誘導(dǎo)GC-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。GC-2 細(xì)胞經(jīng)鐵死亡抑制劑Fer-1 處理后,細(xì)胞中GSH 水平有所升高,MDA 水平得到恢復(fù), 進(jìn)一步證實(shí)鐵死亡與精母細(xì)胞損傷有密切關(guān)聯(lián)。因此, 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 作用的GC-2 細(xì)胞可作為細(xì)胞模型進(jìn)一步探討防治精母細(xì)胞鐵死亡的藥物。
鐵死亡過程中,GPX4 能有效清除脂質(zhì)過氧化物,保護(hù)精子免受氧化損傷[22-23]。GPX4 是一種硒蛋白,可作為GSH 依賴的過氧化物酶清除脂質(zhì)過氧化物而保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化,當(dāng)GSH 合成受阻或者GSH 依賴性的GPX4 在體內(nèi)被抑制時(shí),便會(huì)觸發(fā)鐵死亡。在生殖系統(tǒng)中,GPX4 在生殖器官和精子中大量表達(dá),30% 不育男性精子中GPX4表達(dá)水平降低[24]。GPX4 活性喪失或低表達(dá)已被證實(shí)與精子畸形率增高和生育能力下降有關(guān)[25-26]。ACSL4 是一種將CoA 酯化為特定多不飽和脂肪酸(花生四烯酸和腎上腺酸) 的酶[27]。ACSL4 和GPX4 分別正向和負(fù)向調(diào)節(jié)鐵死亡[28]。HO-1 可以通過釋放血紅素中的鐵來升高細(xì)胞中鐵離子濃度,鐵離子過量可能會(huì)促進(jìn)泛素化脂質(zhì)過氧化物酶的形成,破壞細(xì)胞膜完整性,最終引發(fā)鐵死亡。在雄性生殖系統(tǒng),HO-1 有助于抑制精子和睪丸組織中活性氧的過量積累, 從而保護(hù)精子的功能和完整性[26, 29-31]。上述研究提示: 鐵死亡標(biāo)志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 與雄性生殖損有傷密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示: 10 nmol·L-1 鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 處理的GC-2 細(xì)胞中GPX-4 表達(dá)水平降低,HO-1 和ACSL4 表達(dá)水平升高, 而10 nmol·L-1RSL3 并未對細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯影響,提示鐵死亡標(biāo)志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 表達(dá)水平的變化較細(xì)胞活性變化更為敏感,可作為精母細(xì)胞損傷敏感標(biāo)志分子。
AZA 作用機(jī)制包括其在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閹€嘌呤,從而抑制細(xì)胞增殖,主要用于治療各種炎癥性和自身免疫性疾?。?2-33]。此外,AZA 也展現(xiàn)了抗氧化應(yīng)激的潛力,可能通過影響抗氧化酶的表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞中GSH 水平來保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害[34-35]。鐵死亡發(fā)生時(shí),細(xì)胞中鐵離子釋放到細(xì)胞外,與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性和完整性受損[36]。因此, 鐵死亡與氧化應(yīng)激有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示: AZA 能降低RSL3 誘導(dǎo)的精母細(xì)胞氧化相關(guān)分子MDA 水平,提升抗氧化分子GSH 水平,證實(shí)AZA 抗氧化應(yīng)激的能力;同時(shí)AZA 還可以升高鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 表達(dá)水平且降低ACSL4 和HO-1 表達(dá)水平, 提示AZA 可作為鐵死亡相關(guān)的潛在治療劑,在防治精母細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮作用,該結(jié)果為研究和治療男性不育提供了新的思路。
綜上所述, AZA 通過對鐵死亡標(biāo)志分子和MDA 及GSH 等氧化抗氧化相關(guān)分子的調(diào)節(jié),能夠有效減緩精母細(xì)胞鐵死亡進(jìn)程,從而發(fā)揮對雄性不育的防治作用。
利益沖突聲明:所有作者聲明不存在利益沖突。
作者貢獻(xiàn)聲明:葉嚴(yán)玨參與選題、實(shí)驗(yàn)操作過程、數(shù)據(jù)收集整理和論文撰寫,湯子怡、陽詩盈和譚鈺培參與論文中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,劉永和尹俐參與指導(dǎo)論文撰寫。
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