楊 蕊，張博洋，朱春玲，張洪毅，潘英樹，唐 博，張學明*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.吉林大學 動物科學學院，吉林 長春 130062)

精子發(fā)生是一個高度有序而復雜的過程，生精母細胞(gonocytes)和精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的正常發(fā)育分化受多種激素和細胞因子等的調控[1-2]。在幼齡至性成熟前的雄性個體，其睪丸曲細精索為實芯結構，生精上皮僅由位于曲細精索中部的生精母細胞和位于周邊的未成熟支持細胞(sertoli cells,SCs)構成[3-4]。SCs主要為精原細胞提供支持和營養(yǎng)作用，還有調控精子發(fā)生的功能[5]。隨著日齡的增長和睪丸的發(fā)育，生精母細胞逐漸遷移至生精上皮基膜發(fā)育為SSCs；SCs和SSCs在激素和細胞因子等的調控下協(xié)同發(fā)育，SSCs不斷增殖、分化和遷移，形成各級生精細胞；在青春期的特定階段，生精上皮內側逐漸形成腔隙，腔隙不斷融合擴大成管腔，形成曲細精管[6-8]。因此，生精母細胞和SSCs是精子發(fā)生的基礎，分離培養(yǎng)這些細胞對深入探討精子發(fā)生機理有重要的意義，而其特異分子標記驗證又是分離培養(yǎng)的關鍵環(huán)節(jié)。

目前，人和小鼠生精母細胞和SSCs的特異性分子標記相關研究已取得顯著進展。研究表明，SCs產生的膠質細胞源神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等對生精母細胞和SSCs的自我更新和增殖有重要調節(jié)作用[9]。而GDNF家族受體α-1(GDNF family receptor alpha-1,GFRα-1) 則可用于標記小鼠等的生精母細胞和SSCs[7,10]。但在牛等大家畜，由于缺乏種屬特異性較強的抗體，雖有報道但尚有爭議，有必要進行進一步的驗證[1,11-13]。為此，基于前期工作，本研究從轉錄水平、蛋白表達水平和組織、細胞層面分別探討了這一問題，以期為后續(xù)相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑非必需氨基酸、β-巰基乙醇、青鏈霉素(雙抗)購自Hyclone 公司；0.25% 胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Gibco 公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Biosharp 公司；RNAiso plus購自大連TaKaRa公司；反轉錄試劑盒購自Thermo公司；胰蛋白酶、透明質酸酶購自Sigma；兔抗GFRα-1、Nanog、IgG抗體和SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司；山羊抗兔Alexa Flour?-594購自美國Life Technologies公司；核熒光染料DAPI購自北京碧云天公司；GFRα-1、Nanog、18S RNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 睪丸組織的冷凍保存和復蘇動物實驗均由吉林大學實驗動物福利倫理委員會批準(No.SY201903002)。新生1 d齡健康荷斯坦犢牛睪丸在超凈臺內將白膜剝除并將睪丸剪成體積約0.5 cm3的小塊，參照文獻[1,14]方法將其液氮保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鰞龃婀?，迅速置?7℃水浴中解凍復蘇睪丸組織，一部分用于原代生精細胞分離，另一部分用于石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色、冰凍切片免疫熒光染色或曲細精索漂浮染色。

1.3 RT-PCR按1.2方法去除睪丸間質，收集純化的曲細精索段。用TRIzol Reagent常規(guī)提取總RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩⒓毎俁NA用反轉錄試劑盒反轉為cDNA。PCR反應體系：R-Taq酶12.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，水10.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個循環(huán)，72℃延伸5 min。引物及片段大小見表1。

表1 PCR引物信息

1.4 石蠟切片HE染色將睪丸組織用PBS清洗后在4%多聚甲醛4℃下固定過夜，流水沖洗30 min，常規(guī)脫水、透明、包埋后切片(5 μm)烘干。經二甲苯脫蠟、透明、復水、HE染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片，晾干后觀察拍照。

1.5 生精母細胞分離培養(yǎng)參照文獻[4]方法，將睪丸組織復蘇后PBS清洗，用眼科剪將其充分剪碎，用PBS吹打重懸，靜置10～15 min后棄上清，重復多次直至去掉間質細胞和組織，獲得較純的曲細精索段。加入消化液Ⅰ(含50 mg/L DNaseⅠ及1 g/L 膠原酶Ⅳ的DMEM)，在5% CO2、37℃條件下孵育30 min，隨后用含有10% FBS的DMEM終止消化，離心洗滌(1 000 r/min，5 min)去除上清，加入消化液Ⅱ(含1 g/L胰蛋白酶、1 g/L透明質酸酶、50 mg/L DNase Ⅰ、1 g/L膠原酶Ⅳ的DMEM)同條件孵育5～10 min，孵育過程中需反復在顯微鏡下觀察組織消化程度，有大量單細胞出現(xiàn)后即終止消化；PBS離心洗滌數(shù)次，將所獲細胞用培養(yǎng)液(高糖DMEM+10% FBS+1%非必需氨基酸+0.1% β-巰基乙醇)重懸，40 μm網篩過濾去除未消化的組織塊及細胞團塊，將細胞接種于0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，5% CO2、37℃下培養(yǎng)2 h后觀察并收集未貼壁細胞進行培養(yǎng)。

1.6 免疫組織化學染色組織冰凍切片(30 μm)的免疫染色步驟為：將切片用PBS緩沖的4%多聚甲醛室溫固定30 min，用30% H2O2-甲醇溶液(1∶50)室溫孵育30 min，雙餾水洗2次，再用5% BSA處理20 min；GFRα-1一抗(1∶200)室溫孵育1 h，PBS洗3×5 min(下同)，加入生物素化山羊抗兔二抗(1∶100)室溫下處理2 h；PBS洗后滴加SABC試劑，室溫孵育20 min；PBS洗后用DAB顯色，鏡下控制時間，蒸餾水清洗；封片晾干后顯微鏡下觀察拍照。

1.7 免疫熒光染色曲細精管漂浮免疫熒光染色按如下步驟進下[11,15]。按1.5中所述，分離獲得的曲細精索段置于1.5 mL離心管中(以下都在管中進行)，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗后用50 mmol/L 甘氨酸處理15 min；PBS洗后用PBS+(加4%山羊血清+0.5% Triton X-100)處理1 h，加兔抗GFRα-1(PBS+1∶200稀釋)4℃孵育過夜。次日PBS清洗后用Alexa Fluor?594-山羊抗免IgG(PBS+1∶500稀釋)室溫避光(下同)孵育1 h；PBS清洗后加入DAPI(PBS 1∶1 000稀釋)染色10 min，磷酸緩沖液清洗3×5 min，將染色后的曲細精索段撈出鋪到載玻片上晾干，用抗淬滅劑封片，用Nikon 80iFL-F-P熒光顯微鏡觀察拍照。培養(yǎng)細胞(5 d)的免疫熒光染色步驟基本同上。

2 結果

2.1 Nanog和GFRα-1 mRNA在犢牛曲細精索中的表達RT-PCR分析顯示，犢牛生精上皮有多能性基因Nanog和生精母細胞/精原干細胞標記基因GFRα-1 mRNA的表達，后者的表達水平顯著高于前者(P<0.05)。

圖1 新生犢牛曲細精索生精上皮中Nanog和GFRα-1 mRNA表達的RT-PCR檢測(*示P<0.05)

2.2 GFRα-1蛋白在犢牛生精母細胞中的表達HE染色顯示，曲細精索結構及睪丸間質保存良好，曲細精索中部可見許多SSCs的前體細胞，即生精母細胞，其核質較大，呈大圓形(紅色箭頭)；緊靠基膜位于生精上皮周邊的是細胞核深染的未成熟SCs；生精上皮基膜、長梭形管周肌樣細胞及睪丸間質細胞等結構均清晰可見(圖2A)。以IgG為陰性對照(圖2B)，GFRα-1免疫組織化學染色顯示，曲細精索內的中部有許多大圓形陽性細胞(紅色箭頭)，其位置和分布與圖2A中生精母細胞一致(圖2C)；曲細精索GFRα-1免疫熒光漂浮染色全鋪片結果進一步顯示，GFRα-1陽性細胞位于曲細精索中部，與圖2A、C顯示的生精母細胞一致。

A.HE染色；B～C.GFRα-1免疫組化染色(B為陰性對照)；D～F.曲細精索GFRα-1免疫熒光漂浮染色(D為DAPI染色示核，E為GFRα-1陽性信號，F(xiàn)為DAPI/GFRα-1融合)紅色箭頭示生精母細胞

2.3 GFRα-1在體外培養(yǎng)犢牛生精母細胞/SSCs中的表達犢牛生精上皮細胞原代培養(yǎng)2 h后部分細胞(主要是SCs)貼壁極化，伸出多個突起，而生精母細胞尚未貼壁。此時，收集懸浮細胞(主要為生精母細胞)進一步培養(yǎng)，5 d后進行免疫熒光染色鑒定(圖3)。這些細胞表現(xiàn)為典型的生精細胞形態(tài)，呈單個、成對、團鏈狀、簇狀存在(圖3A,E，紅色虛線和箭頭)，貼附在少量未去除凈的有巨大扁平核的SCs上(圖3B,D,F,H，白色箭頭)生長，仍有GFRα-1和Nanog蛋白的表達(圖3C,D,G,H)。

A,E.差速貼壁分離培養(yǎng)5 d后明場示單個、成對、團鏈(簇)狀的生精母細胞/SSCs；B,F.DAPI染色；C.GFRα-1陽性染色；D.DAPI/GFRα-1融合；G.Nanog陽性染色；H.DAPI/Nanog融合；紅色箭頭示生精母細胞/SSCs；白色箭頭示SCs核

3 討論

哺乳動物精子發(fā)生是一個持續(xù)不斷的細胞增殖與分化過程。在新生個體的睪丸中，曲細精索呈實芯狀，此時生精上皮僅由位于中部的生精母細胞和周邊的未成熟SCs兩類形態(tài)截然不同的細胞組成[1,3-4,11]。這一階段在不同物種持續(xù)的時間不同，因細胞類型少，所以此階段有利于生殖細胞或SCs分離純化。隨著睪丸發(fā)育的進行，SCs不斷接近成熟；生精母細胞則從中央漸向上皮基膜遷移并不斷增殖分化，到達由基膜和SCs突起及緊密連接等結構形成的基底室，形成SSCs。SSCs通過自我更新和多次增殖分化，形成單個型(Asingle,As)、成對型(Apaired,Apr)、鏈狀(Aaligned,Aal)、A1-4型、間型(intermediate)、B型精原細胞及精母細胞、精子細胞、精子等，鑲嵌在SCs胞質側面和頂部形成的凹陷中[3,7]。接近性成熟時，曲細精索中部逐漸形成管腔，此時稱為曲細精管，此時生精上皮由成熟SCs和各級生精細胞組成，細胞類型較為復雜，不利于各類細胞的分離純化及其分子標記檢測。鑒于以上原因，本研究選用新生1 d齡犢牛睪丸為試驗材料。

在嚙齒類、人、猴等物種，GFRα-1可作為SSCs的相對特異的分子標記已取得共識[7,10,16]。在牛、羊、豬等大家畜，由于缺乏有種屬特異性的抗體等因素，GFRα-1在生精母細胞/SSCs的表達雖有報道，但仍有爭議[1,11-13]。為此，本試驗從轉錄水平和蛋白水平、組織細胞原位和體外培養(yǎng)方面探究了這一問題。首先，分離了犢牛曲細精索片段，提取了生精上皮總RNA，RT-PCR方法檢測了Nanog和GFRα-1 mRNA水平的表達。Nanog是細胞多能性因子之一，其表達與生精母細胞/SSCs可分化為三胚層來源組織細胞的報道一致[17]。高水平GFRα-1 mRNA的表達提示其可作為生精母細胞/SSCs的分子標記。

HE染色顯示，犢牛曲細精索中生精母細胞的形態(tài)和位置與小鼠一致[8]。在此基礎上，本試驗分別用普通免疫組化技術和曲細精索漂浮免疫熒光染色技術研究了GFRα-1在犢牛生精母細胞中的表達。這些GFRα-1陽性細胞的形態(tài)、大小和位置與HE染色切片中所示的生精母細胞完全一致。這從蛋白表達水平說明，GFRα-1可作為犢牛生精母細胞的分子標記。

本試驗進一步用二步酶消化和差速貼壁法分離了犢牛生精母細胞，探討了體外培養(yǎng)中這些細胞是否持續(xù)表達GFRα-1。形態(tài)學觀察結果表明，牛生精母細胞經短暫培養(yǎng)后，其后代細胞表現(xiàn)出典型的SSCs或未分化精原細胞的特征，即呈單個存在的As型和由不完全胞質分裂形成的細胞間橋(intercellular bridges)相連的Apr、Aal型等[7,10,17]。免疫熒光染色顯示，這些細胞不但持續(xù)表達GFRα-1蛋白，還表達多能性標記蛋白Nanog，提示其為生精母細胞來源細胞且有一定干性(stemness)。

綜上所述，本研究基于前期基礎，從mRNA和蛋白水平、組織細胞原位表達和培養(yǎng)細胞表達等方面，驗證了GFRα-1在牛生精母細胞及其后代細胞SSCs中的表達，為后續(xù)相關研究奠定了基礎。