麻芯茹，郭 寒，張 偉，李 銘，趙瑩瑩，王 爽，呂鑫泉，李 享，徐 闖*，楊 威*，張冰冰*

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶163319)

奶牛業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，奶牛飼養(yǎng)業(yè)是現代國家農業(yè)的核心行業(yè)，與此同時奶牛相關營養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)病率也在不斷升高[1]。除了牧場的日常管理與預防，奶牛其自身機體的免疫也是極其重要的。其中先天免疫作為動物機體的第一道防線，中性粒細胞(PMN)是先天免疫反應的主要效應細胞,約占白細胞總量的70%[2]，細胞顯示出強大的抗菌功能，包括遷移、黏附、吞噬、脫粒和中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)。NETs形成過程的主要特征是核重排：核小葉丟失，伴有染色質縮合并同時使顆粒解體。在后期階段核膜解體，隨后細胞內容物被彈射到細胞膜上，細胞外空間形成NETs[3]。NETs可以結合微生物，阻止微生物傳播，NETs的產生和網狀組織被認為是無菌性炎癥中非常重要的武器。PMN衍生的微囊泡代表了另一種機制，通過這種機制，PMN可以放大炎癥過程，在損傷部位和血液中都能發(fā)現高水平的炎癥過程[4]。

有研究表明，NETs的形成可以在保留PMN功能的情況下進行，包括吞噬和趨化功能。這種現象被稱為生命性NETs；相反則稱為自殺性NETs。自殺性NETs與生命性NETs的主要區(qū)別在于刺激的性質，其中自殺性NETs多由佛波肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)誘導[5]。可通過激活蛋白激酶C活化泛素連接酶-促分裂原活化的蛋白激酶-胞外信號調節(jié)激酶信號轉導通路，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進而促發(fā)NETs釋放[6-7]。PMA具有廣泛的生物學活性,在動物體內可誘導多種細胞因子的生成、調節(jié)心肌細胞、促癌因子作用等[8]。旨在研究不同時間與濃度的PMA刺激PMN對NETs形成的影響。

細胞內Ca2+是最重要的第二信使，對真核細胞的廣泛生物學過程至關重要[9]，Ca2+釋放激活的Ca2+(CRAC)通道是細胞內鈣的主要來源，由鈣通道蛋白Orai1組成，形成通道的Ca2+滲透孔。Ca2+升高有利于ROS代謝途徑的產生進而增加活性氧(ROS)的表達[10]，而NETs細胞死亡過程不同于凋亡和壞死，取決于NADPH氧化酶產生的ROS[11]。ROS可以觸發(fā)細胞內NETs的增加并通過調節(jié)內質網、線粒體、質膜上的Ca2+傳感器和轉運蛋白來調節(jié)Ca2+的水平[12]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物自黑龍江省大慶市某集約化奶牛場選取體況相似的健康奶牛，尾靜脈采血,肝素抗凝管抗凝。

1.2 主要試劑牛外周血PMN分離試劑盒、多聚賴氨酸購自北京索萊寶科技有限公司；PBS緩沖液購自Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、PMA購自Sigma；Hoechst33342核染抗熒光衰減封片劑(含DAPI)購自北京索萊寶試劑公司；Ca2+熒光探針購自碧云天生物技術有限公司；ROS檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；siOrai1 RNA與siRNA-mate轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.3 奶牛血液PMN的分離在清晨喂料之前，選取體況相近且無任何疾病的奶牛，固定后通過尾靜脈采血后收集到肝素抗凝管內，根據牛外周血PMN分離試劑盒分離PMN，在15 mL離心管內按比例先后加入試劑盒中的A液、C液與血液，離心收集細胞，待紅細胞裂解液完全后，洗滌3次即為PMN。

1.4 NETs檢測將包被好的多聚賴氨酸爬片放入12孔板，調整PMN濃度后將細胞放入板內，添加PMA刺激后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。棄掉12孔板內的培養(yǎng)基，PBS清洗3次，吸盡PBS后，加入300 μL的4%多聚甲醛固定，重復PBS清洗。去除爬片上的多余液體，載玻片上滴1滴Hoechst33342核染抗熒光衰減封片劑，避光，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 在不同PMA刺激時間的條件下培養(yǎng)PMN將1.3分離的健康組的PMN分成6組，每組分別用加入100 nmol/L的PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經37℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1，2，3，4，5，6 h，根據1.4步驟通過激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 在不同PMA濃度的條件下培養(yǎng)PMN將1.3分離的健康組的PMN分成4組，每組分別用加入10，50，100，200 nmol/L PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，根據1.4步驟通過激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 沉默Orai1基因將分離出的PMN調整濃度后，為穩(wěn)定細胞，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，根據吉瑪基因轉染試劑說明書進行轉染，根據siOrai1 RNA引物序列(表1)，設計引物沉默Orai1基因。設計對照組，不加入siOrai1 RNA沉默24 h。

表1 siOrai1 RNA引物序列

1.8 流式細胞術檢測鈣為了分析Orai1基因對NETs內鈣的影響，將收集到的PMN調整密度后，按照1.7方法沉默24 h后加入PMA刺激3 h，清洗后經改良臺氏液重懸后，經Fluo-3AM試劑盒配比稀釋染色，避光37℃孵育30 min，清洗后上機檢測。

1.9 流式細胞術檢測ROS為了分析Orai1基因對NETs內ROS水平的影響，將收集到的PMN調整密度后，進行1.7步驟沉默24 h后加入PMA刺激3 h，經改良臺氏液重懸后，根據普利來ROS檢測試劑盒說明書操作，清洗后通過FCM測定熒光強度。

2 結果

2.1 不同PMA刺激時間的條件下PMN NETs檢測經激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示，奶牛PMN經PMA刺激3 h，NETs的形成效果最好(圖1)。

2.2 不同PMA刺激濃度的條件下PMN NETs檢測如圖2所示，激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明，PMA濃度為100 nmol/L時，奶牛血液PMN細胞NETs的形成效果最好。

A.～D.分別為10，50，100，200 nmol/L PMA刺激3 h形成的NETs

2.3 檢測PMA刺激下PMN內Ca2+水平如圖3可見，沉默PMNOrai1后， NETs內Ca2+極顯著降低，表明NETs通過Orai1影響Ca2+水平(P<0.01)。

A.轉染siNEG和siOrai1細胞中的Ca2+表達水平；B.轉染siNEG和siOrai1細胞中的Ca2+水平相對豐度；“**”表示對照組和沉默PMN Orai1呈現極顯著性差異

2.4 檢測PMA刺激下PMN內ROS水平由圖4可見，沉默Orai1后，NETs內ROS水平明顯降低(P<0.05)。

A.轉染siNEG和siOrai1細胞中的ROS表達水平；B.轉染siNEG和siOrai1細胞中的ROS水平相對豐度；“**”表示對照組和沉默PMN Orai1呈現極顯著性差異

3 討論

PMN是維持機體生理狀態(tài)穩(wěn)定的重要細胞，其能對破壞機體屏障的病原體做出快速和多樣化的反應，并使組織恢復到無菌狀態(tài)。PMN能有效地吞噬和殺死微生物，在動物非特異性免疫系統中起關鍵作用[13]。NETs形成是一種新的PMN程序性死亡方式，是一個多步驟的死亡途徑[14]，通過髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)對抗細胞外微生物。而NE缺陷型小鼠不能形成NETs，表現出免疫缺陷[15]。

PMA刺激的PMN釋放DNA，形成細胞外網狀結構，修飾殺菌蛋白。本研究發(fā)現PMA誘導1 h后NETs形成較少，在刺激2～3 h后NETs形態(tài)逐漸增加，4～6 h后開始下降。分別用10，50，100，200 nmol/L PMA刺激3 h，結果發(fā)現，100 nmol/L的PMA形成NETs效果最好。

Ca2+在細胞的信號傳導和執(zhí)行功能等各方面發(fā)揮著重要作用，由于內質網的體積小，內質網的Ca2+儲量減少會導致細胞質Ca2+的增加很小。所以當細胞被激活時，儲存在內質網中的Ca2+被釋放。進而細胞內的主要來源是由Ca2+釋放激活Ca2+產生的，Ca2+通過釋放激活位于質膜中，由鈣通道蛋白Orai組成，這些通道蛋白具有很高的Ca2+選擇性，形成通道的Ca2+滲透孔，從而使鈣流入細胞，以確保連續(xù)的細胞外來源的Ca2+。流式細胞檢測結果表明，當PMN沉默Orai1,NETs內Ca2+水平極顯著降低，證明PMN成功沉默Orai1，影響奶牛血液PMN Ca2+進入細胞內，進而影響細胞內Ca2+濃度。NETs的形成取決于ROS的產生，ROS使PMN能夠通過NADPH氧化酶激活來滿足其抗菌功能。沉默Orai1導致NETs內ROS表達極顯著下降，由于沉默Orai1影響細胞內Ca2+，從而影響NETs狀態(tài)下的ROS水平。

奶牛PMN在100 nmol/L的PMA條件下刺激3 h NETs形成的效果最好。沉默PMN膜上Orai1蛋白，導致NETs內Ca2+和ROS水平降低。