馬 駿 ，童 奇 ，高良弼 ，朱 川 ，江志強

（1.長興縣公安司法鑒定中心，浙江 長興 313100；2.安吉縣公安司法鑒定中心，浙江 安吉 313300）

法醫(yī)DNA分析技術在刑事司法實踐中的作用日益凸顯。大多數性侵案件中，常常遇到混合斑的DNA檢驗，如何從女性陰道分泌液與男性精液組成的混合斑中獲得精子細胞是檢驗鑒定的關鍵，而精子的個體來源鑒定又是案件偵破和訴訟的關鍵。一般此類混合斑的檢材載體類型較多，采用常規(guī)的差異裂解法[1]對精子細胞進行分離，實驗時間長，步驟繁瑣，特別是在女性陰道上皮細胞大量存在而精子細胞較少時，很難獲得完整、單一的精子細胞DNA分型，有時即使獲得了分型結果，也多為混合分型[2]。而在實踐中面對大量檢材時，常要求在短時間內進行精子細胞的提取，但存在消耗時長和提取效率之間的不平衡?；诖?，筆者運用尼龍膜套管分離技術，建立一種新型的混合斑中精子細胞分離的方法，以有效解決上述難題。

1 材料與方法

1.1 材料

40份男女性混合斑檢材來源于長興縣公安局所承辦的性侵案件，其中陰道拭子26份、內褲8份、床單3份、衛(wèi)生紙2份、衛(wèi)生棉1份。

1.2 主要試劑和儀器

人精液PSA檢測金標試劑條（德國MERCK公司），硅膜試劑盒（Forensic DNA Extraction Kit for Soft Tissues，加拿大 Pulse 公司），AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴增試劑盒（美國AB公司）。

尼龍膜套管（加拿大Pulse公司），9700型PCR儀、3500xL基因分析儀（美國AB公司），5355型恒溫混勻儀（德國Eppendorf公司）。

1.3 精子細胞分離方法

依據GA 766—2008人精液PSA檢測金標試劑條法[3]對40份檢材（1～40號）進行檢驗，結果均呈陽性，其中21、29號（陰道外口拭子）和36號（現(xiàn)場床單）檢材為弱陽性。對所有樣本分別采用常規(guī)差異裂解法和尼龍膜套管分離技術對精子細胞進行分離。

1.3.1 常規(guī)差異裂解法

通過多波段光源照射，剪取40份檢材上可疑斑跡適量（約0.5cm×0.5cm），置于1.5mL離心管中，剪碎，加入 TNE 緩沖液 900 μL、10%SDS 裂解液 100 μL、10mg/mL蛋白酶K 7μL，37℃下置于5355型恒溫混勻儀上混勻4h。

將1.5mL離心管漩渦振蕩1min。采用套管離心法（離心半徑 7cm，5000r/min，離心 15 min），用 1 mL TNE緩沖液浸潤后，以離心半徑7cm，5 000 r/min，離心10min，棄去上清液。外部1.5mL離心管得沉淀精子及女性DNA殘留物，加入1 mL TNE緩沖液重新懸浮，以離心半徑7cm，13000r/min，離心5min，重復3次后棄去上清液，得到精子細胞沉淀約50μL。

1.3.2 尼龍膜套管分離技術

通過多波段光源照射，剪取40份檢材上可疑斑跡適量（約0.4 cm×0.4 cm），置于2 mL離心管中，剪碎，加入 TNE緩沖液 1.35 mL、10%SDS裂解液 150 μL、10 mg/mL蛋白酶K 12 μL，56℃下置于 5355型恒溫混勻儀上混勻4h。

將2mL離心管漩渦振蕩1min，以離心半徑7cm，2500r/min，離心2min[4]，分批次吸取上清液加入尼龍膜內套管中，10 000×g離心1 min，期間更換外套管。用600μL TNE緩沖液清洗離心管內檢材1次，漩渦振蕩1min，以離心半徑 7cm，2500r/min，離心 2min，吸取上清液至前述尼龍膜內套管中，10 000×g離心1min。用600μL TNE緩沖液清洗內套管分離的精子細胞3次，10000×g離心1min，內套管尼龍膜上得分離精子細胞。

為驗證精子細胞是否完全被尼龍膜截獲，分別收集最后的清洗液，10000×g離心5min，得沉淀約50μL，按照精子細胞DNA提取方法提取，檢驗是否有精子細胞被清洗濾過尼龍膜。

1.4 精子細胞DNA的提取、PCR擴增與分型檢測

將分離所得的精子細胞使用硅膜試劑盒進行提取。

經過兩種方法提取的精子細胞DNA模板采用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴增試劑盒在9700型PCR儀上進行復合擴增，擴增體系為10μL，擴增產物使用3500xL基因分析儀進行電泳分離和激光掃描分析，采用GeneMapperTMID-X v1.4軟件分析獲得檢材的STR分型結果。

2 結 果

40份混合斑檢材采用兩種提取方法的分型結果見表1。采用尼龍膜套管分離技術分離的檢材僅3份有女性成分微弱殘留，其余均獲得了完整的單一男性精子細胞STR分型，峰值均在4000～30000RFU，均衡性較好。采用常規(guī)差異裂解法分離的檢材中，有25份完全未檢出男性精子細胞STR分型，15份檢出男性精子細胞STR分型（7份為不完整的男性精子細胞STR分型，6份有女性成分殘留，2份為完整的單一男性精子細胞STR分型）。

尼龍膜套管最后的清洗液沉淀中未檢出男性精子細胞，說明在高速離心清洗時無精子細胞透過尼龍膜，精子細胞無明顯損失。

表1 40份混合斑檢材采用兩種提取方法的分型結果 （N=40）

3 討 論

性侵案件中混合斑檢材的載體類型較為復雜，一般情況下，陰道拭子、內褲較多。常規(guī)差異裂解法對精子細胞進行分離，往往都在體積較小的1.5 mL離心管中[5]，振蕩分離時空間有限，不利于精子細胞與載體的分離。因此，混合斑中的精子細胞DNA能否檢驗成功，關鍵在于能否實現(xiàn)精子細胞與載體的分離[6]。

尼龍膜套管包括柱狀內管和2 mL離心外管，內管直徑約8mm、長2.5cm（最多可加入800μL液體），底部為孔徑0.45 μm的尼龍膜（經過疏水處理），對DNA低吸附，在無離心力的作用下液體無法滲漏。精子細胞膜富含硫醇蛋白[7]，需在二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇等還原劑的作用下才能打開其中的二硫鍵，從而破膜釋放DNA[8]。精子細胞一般頭部長 3.0～5.0μm、寬 2.0～3.0μm，體部長 5.0～7.0μm、寬1.0μm，尾部長40～60μm[9]，根據分子篩原理，當消化后的混合液體流經內管后，未被消化的精子細胞經過濾被攔截在尼龍膜內，女性上皮細胞DNA成分隨溶液穿過尼龍膜進入外套管內，從而達到物理分離精子細胞的目的。

本研究在第一步消化時直接采用56℃孵育，能提高蛋白酶K的裂解效率（蛋白酶K在56～65℃時活性較高[10]），精子在硫醇蛋白的保護下不受影響，而女性上皮細胞則能夠基本消化干凈，運用低速離心分離去除載體，再利用尼龍膜過濾，高速離心收集精子細胞，從而達到物理分離精子細胞的目的。尼龍膜套管具有疏水、低吸附DNA的特性，女性DNA成分幾乎不會殘留在尼龍膜上，清洗精子細胞時也不會因為操作因素導致精子細胞的損失，使得分離較為徹底。

本研究中有部分陰道中段拭子和棉質內褲的檢材通過尼龍膜套管分離技術檢出女性成分殘留，分析其原因是女性上皮細胞含量較多，增加洗滌次數可以解決該問題。常規(guī)差異裂解法中部分載體（如床單、絲質內褲、衛(wèi)生紙、衛(wèi)生棉）檢出率較低，分析其原因是載體的纖維有較強的吸附力，精子細胞與載體分離不徹底，與尼龍膜套管分離技術相比，常規(guī)差異裂解法洗脫能力有限。因此，尼龍膜套管分離技術檢出完整的單一男性分型的數量要高于常規(guī)差異裂解法，尼龍膜對于精子細胞的分離也較為徹底。

當然，混合斑中精子細胞的分離方法還有很多，如激光捕獲顯微切割技術、顯微操作、流式細胞儀技術、免疫磁珠沉淀等[8]，但是，多數方法對于實驗操作者的經驗和技術要求較高，基層實驗室在相關儀器設備的配備上也有限制，因此，在大量的日常檢案中很難發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究建立的尼龍膜套管分離技術適用于混合斑中精子細胞的分離，可以將混合斑中精子細胞和女性細胞的DNA徹底分離，減少精子損失，特別是對含有大量女性細胞且精子細胞較少的檢材提取效果明顯，整個提取實驗成本低廉、快速簡便，無需特殊設備，在日常檢案中具有較高的應用價值。