劉 鑫

山東警察學(xué)院 山東省濟(jì)南市 250014

疑難生物檢材DNA的檢驗(yàn)探究

劉 鑫

山東警察學(xué)院 山東省濟(jì)南市 250014

疑難生物檢材根據(jù)類型的不同可分為微量DNA檢材，DNA降解檢材，DNA抑制劑含量超高的檢材以及混合DNA檢材。本文對這四種常見的疑難生物檢材DNA的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了探究，并介紹了一種新的用在DNA抑制劑含量超高的檢材中的SCODA電泳提取純化技術(shù)。

疑難生物檢材；DNA微量檢材；降解DNA檢材；DNA抑制劑含量超高的檢材；SCODA

經(jīng)過20多年法醫(yī)工作人員的實(shí)踐和不斷努力，PCR-STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)已逐漸成為了法醫(yī)DNA的常規(guī)檢測方法，它具有靈敏度高、分辨率高等特點(diǎn)，在實(shí)踐中發(fā)揮了極其重要的作用，為偵查破案提供了強(qiáng)有力的線索和證據(jù)。

但隨著社會(huì)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，犯罪分子的反偵察能力、作案手段不斷提高，出現(xiàn)了許多在現(xiàn)有技術(shù)檢測方法基礎(chǔ)上無法很好解決的一些問題。如在“兩搶一盜”案件中，經(jīng)常出現(xiàn)的如手套、面罩等脫落細(xì)胞類的微量物證等；以及在強(qiáng)奸案中出現(xiàn)的混合精斑等；以及在無名尸案件中出現(xiàn)的腐爛組織等；還有受各種抑制劑所影響DNA的提取、擴(kuò)增等的疑難檢材等等。

通常情況下，我們將這些使用常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)無法或難以得到理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的生物檢材，稱之為疑難生物檢材。按照類型的不同，它可以分為：

（1）微量DNA檢材；（2）DNA降解檢材；

（3）DNA抑制劑含量超高的檢材；（4）混合DNA檢材。

1 微量DNA檢材

微量DNA檢材又稱為低拷貝檢材（low copy number，LCN），它是指DNA含量少于100pg，相當(dāng)于15個(gè)雙倍體或30個(gè)單倍體細(xì)胞中的DNA量[1]。

微量DNA檢材，通常來源于犯罪分子接觸過的日常用品、衣物、作案工具等。根據(jù)羅卡定律（Locard exchange principle），“凡是兩個(gè)物體接觸，必然會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移”[2]，那么凡是與人體接觸了，接觸部位就會(huì)留下人體的脫落細(xì)胞。目前，隨著犯罪分子的反偵察意識(shí)越來越強(qiáng)，致使我們越來越難在現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)提取到如血跡或血斑、精液或精斑、唾液或唾液斑等一系列的“顯而易見”的生物檢材。那么這些具有隱蔽、體積小、不易發(fā)現(xiàn)等特點(diǎn)的微量檢材則成為了破案的關(guān)鍵所在。但由于微量檢材中的DNA含量較少，所以保證DNA的提取效率以及DNA的有效使用效率是此類檢材檢驗(yàn)的關(guān)鍵。

那么，現(xiàn)階段針對微量DNA檢材的解決方案主要有[3]：

（1）增加PCR的循環(huán)數(shù)；

（2）通過各種商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行純化濃縮；

（3）擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的純化技術(shù)；

（4）全基因組的擴(kuò)增技術(shù)；

（5）激光捕獲顯微切割技術(shù)；

（6）巢式PCR技術(shù)；

（7）SNP技術(shù)及mini-STR檢材體系的應(yīng)用；

（8）使用高純度的甲酰胺及改變相應(yīng)的電泳條件；

（9）低體積的PCR擴(kuò)增技術(shù)。

此外，大量的一線工作者在不斷的實(shí)踐探索中也找到了一些針對微量檢材提取較為成功的方法。董迎春等人4回顧性分析了2012年以來的1025例涉案手機(jī)和電腦接頭類檢材的DNA檢驗(yàn)情況，證實(shí)了他們所使用的改良硅珠法具有便捷、省時(shí)、高效、檢驗(yàn)效果理想等特點(diǎn)，可以較好的適用于法醫(yī)微量物證DNA的檢驗(yàn)。其中這里的改良硅珠法，它使用了具有過濾雜質(zhì)功能的離心套管，降低了硅珠懸濁液的使用量，簡化了漂洗步驟，并使用小體系的洗脫液進(jìn)行洗脫等等。這些步驟不僅簡化了實(shí)驗(yàn)操作，而且降低了DNA的損耗，并最終提高了DNA的濃度。

2 DNA降解檢材

當(dāng)生命體新陳代謝停止后，如果生物檢材在外界環(huán)境下長時(shí)間的暴露，細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)因?yàn)楣庹铡穸纫约拔⑸锏雀鞣N物理、化學(xué)、生物作用而發(fā)生降解，使DNA分型成功率顯著降低。

而現(xiàn)在隨著犯罪分子的反偵察意識(shí)的不斷增強(qiáng)，作案手段的不斷提高，人為的導(dǎo)致生物檢材降解的可能性越來越大，比如掩埋、焚燒、沉湖、化學(xué)試劑浸泡等等一系列作案手段，都給DNA的提取檢驗(yàn)工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

一般來說，影響生物檢材降解的因素主要有[3]：

（1）溫度。溫度是影響生物檢材降解的最重要的因素。溫度每升高20℃，生物大分子的降解速率提升10～25倍。此外，低溫也可降低生物降解的速度5。

（2）濕度。游離態(tài)的水分子會(huì)直接的促使生物檢材中的DNA分子降解，而極度干燥的環(huán)境也可能會(huì)造成DNA分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

（3）其它因素，主要包括核酸酶、土壤微生物、以及強(qiáng)酸強(qiáng)堿、紫外線等因素等等。

現(xiàn)階段，針對DNA降解檢材，DNA的檢測方法主要有[5]：

（1）對大片段的DNA進(jìn)行回收；

（2）對DNA進(jìn)行修復(fù)；

（3）縮短擴(kuò)增子；

（4）線粒體DNA的測序；

（5）全基因組擴(kuò)增；

（6）電泳前先進(jìn)行相應(yīng)的純化工作；

（7）其他方法。

3 DNA抑制劑含量超高的檢材

對于某些生物物證檢材樣本的分析，往往會(huì)受從檢材中提取到的DNA的質(zhì)量和數(shù)量所影響。而生物物證檢材通常都會(huì)包含一些抑制劑，而這些抑制劑將會(huì)影響DNA的純化和PCR擴(kuò)增。常見的DNA抑制劑有：存在于毛發(fā)和組織中的黑色素；存在于骨骼和組織中的膠原和磷酸鈣；存在于土壤中的腐殖酸；存在于新鮮血液中的血紅素以及存在于衣物和各種紡織品中的單寧和染料等。

近年來，人們?yōu)榱巳コ@些PCR抑制劑，嘗試了各種各樣的方法，比如稀釋DNA樣本，加入牛血清蛋白，以及在PCR中加入額外的Taq酶等等。

現(xiàn)階段，一種新型的SCODA6（同步旋轉(zhuǎn)電場技術(shù)）正逐步進(jìn)入人們的視野中。SCODA技術(shù)可以在不同類型的樣本中，提取DNA，去除抑制劑，同時(shí)對DNA進(jìn)行濃縮。SCODA技術(shù)利用交互的電磁場，使帶有電荷的DNA集中在中央，而其它的不帶電荷的物質(zhì)則遠(yuǎn)離磁場，從而達(dá)到將DNA與抑制劑分離的目的。研究表明，SCODA可以有效的移除用一般的二氧化硅膜無法清除的抑制劑。除此之外，SCODA技術(shù)中存在的濃縮的步驟，可以增大提取的體積，促進(jìn)DNA的修復(fù)。SCODA技術(shù)在許多富有挑戰(zhàn)性的樣品，如骨頭和稀釋過的可疑斑點(diǎn)等含抑制劑較高的疑難檢材中均具有很好的效果。

研究表明，SCODA電泳提取純化技術(shù)相對于傳統(tǒng)的純化試劑盒的優(yōu)勢明顯，主要包括：

（1）它可以提高低拷貝DNA檢材的提取量和純度，獲得更高PCR擴(kuò)增的成功率；

（2）它可以高效的去除檢材中的抑制劑和污染物。有效的去除血液、組織、毛發(fā)、骨頭、紡織品、土壤等各種檢材中的抑制劑和污染物。與傳統(tǒng)技術(shù)相比較發(fā)現(xiàn)，SCODA技術(shù)對污染物的去除更徹底，可直接用于后續(xù)的擴(kuò)增、克隆和分析；

（3）它可以有效的保持DNA片段的完整性，不會(huì)因機(jī)械作用而造成DNA片段的損傷或者毀壞。

4 混合DNA檢材

混合DNA檢材，通常來講，是由兩名或兩名以上個(gè)體的血液、精液、分泌物、排泄物、脫落上皮細(xì)胞等同種或不同種類型的DNA附著在不同的犯罪現(xiàn)場載體上形成的。在實(shí)際的案件中，以強(qiáng)奸案中精液和陰道分泌液組成的混合檢材最為常見。近年來，由于現(xiàn)場勘察技術(shù)的提高，儀器檢測靈敏度的增強(qiáng)以及實(shí)驗(yàn)室操作水平的提升等種種因素，使得及其微量的DNA也可能被檢測到，那么隨之而來的混合DNA檢材所占的比例也越來越高。如入室盜竊，搶劫，打架斗毆等案件中，混合檢材出現(xiàn)的可能性越來越大。此外，混合樣本也可能來源于污染，包括檢材采集人員或?qū)嶒?yàn)室檢驗(yàn)人員的污染，以及實(shí)驗(yàn)儀器及耗材品的污染等等。

現(xiàn)在，對混合DNA檢材的檢驗(yàn)分析主要著重于[3]：

（1）常規(guī)實(shí)驗(yàn)完成后，利用相關(guān)的軟件進(jìn)行分解；

（2）在實(shí)驗(yàn)階段，對組分進(jìn)行相應(yīng)的分離；

（3）用特定的試劑盒來檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)組分。

目前，國內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室對于混合DNA圖譜主要進(jìn)行的是人工手動(dòng)拆分。主要拆分方法為：根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)下存在的峰的個(gè)數(shù)、峰高等參數(shù)進(jìn)行拆分。但是人工拆分的主觀因素較大；考慮的因素比較單一，只是單個(gè)位點(diǎn)，逐個(gè)的去拆分，沒有整體考慮整個(gè)圖譜；拆分時(shí)沒有量化的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不確定性較大。而國際上則較多的借助軟件進(jìn)行拆分，軟件主要是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法去解釋混合圖譜的數(shù)據(jù)。軟件拆分的優(yōu)勢在于：有可量化的標(biāo)準(zhǔn)；可重復(fù)性好；減少主觀性，結(jié)果更加客觀公正。

綜上所述，我們依次對微量DNA檢材，DNA降解檢材，DNA抑制劑含量超高的檢材以及混合DNA檢材的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了探究。在今后的疑難生物檢材提取時(shí)，要結(jié)合實(shí)際案例，尋求最有效的方法，盡可能的完成DNA的檢驗(yàn)。

[1]張瑤.淺談爆照案件的特點(diǎn)及偵防對策[J].中國刑警學(xué)院學(xué)報(bào),2008(02):20-21.

[2]黨華偉,毛炯,王惠,黃江平,白小剛.疑難生物檢材法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(01):52-54.

[3]董迎春,李詩柳,言夢非,劉宗偉,朱怡.1025例涉案手機(jī)和電腦接頭類檢材的DNA檢驗(yàn)分析[J].刑事技術(shù),2015,40(04):332-333.

[4]侯一平．法醫(yī)學(xué)進(jìn)展與實(shí)踐(第七卷)[M].成都：四川大學(xué)出版社,2010:1-6.

[5]Sarah Schmedes & Pamela Marshall& Jonathan L.King &Bruce Budowle.Effective removal of co-purified inhibitors from extractedDNA samples using synchronous coefficient of drag alteration[J].Int J Legal Med,2013,127:749-755.

劉鑫（1988-），女，山東省淄博市人。助教。山東警察學(xué)院研究生，法醫(yī)學(xué)。