高洪梅 ，王 昌 ，張珊珊 ，肖東杰 ，孫善會(huì) ，汪運(yùn)山 ，張茂修

（1.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250013；2.濟(jì)南迪恩法醫(yī)司法鑒定所，山東 濟(jì)南 250013）

常染色體STR基因座由于突變率低、穩(wěn)定遺傳及高度遺傳多態(tài)性而廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別及親權(quán)鑒定[1]。目前常染色體親權(quán)鑒定試劑盒均包含13個(gè)核心STR基因座，但要求檢測系統(tǒng)的累積非父排除率和個(gè)體識(shí)別率均應(yīng)達(dá)到0.9999以上[2]。目前，基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司推出并廣泛應(yīng)用的常染色體STR試劑盒有Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A和22NC，共包括40個(gè)常染色體STR基因座（D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）。 前期研究[3]對(duì) Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A包含的19個(gè)常染色體STR基因座在山東漢族人群的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。Y-STR基因座具有獨(dú)特的父系遺傳方式。而對(duì)于X染色體，父親的X-STR可遺傳給女兒，母親的X-STR可遺傳給兒子及女兒。目前X-STR和Y-STR在法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用廣泛[4-6]。在親權(quán)鑒定中，當(dāng)有限的常染色體STR基因座檢測出基因突變，在了解案例的遺傳背景前提下，增加檢測X-STR和Y-STR基因座對(duì)鑒定意見的出具可起到補(bǔ)充作用。在親權(quán)鑒定案例中，同一個(gè)樣本用不同的試劑盒進(jìn)行檢測，可出現(xiàn)個(gè)別STR基因座分型結(jié)果不一致，存在等位基因的丟失，這給親權(quán)鑒定結(jié)果的分析帶來風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。

本研究對(duì)常染色體Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)涵蓋的、前期研究[3]尚未分析的其他21個(gè)常染色體STR 基因座（D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）在山東漢族人群中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測存在基因突變可能的案例，增加檢測常染色體STR基因座和X-STR（Y-STR）進(jìn)行分析。另外，對(duì)用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒及樣本測序分析，評(píng)估多套試劑盒在親權(quán)鑒定中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

日常鑒定案件中山東漢族人群273份無關(guān)個(gè)體的樣本（男性137份，女性136份）用于21個(gè)常染色體STR基因座的遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測，存在基因突變可能的鑒定案例共6例，其中三聯(lián)體1例，二聯(lián)體5例。另外用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例有3例。樣本采集前均告知當(dāng)事人并征得同意。

1.2 主要試劑與儀器

Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng) 20A、25A、22NC、20Y、17X［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），DNA標(biāo)準(zhǔn)品采用9947A和9948A。

Hema 9600梯度基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），3500xL基因分析儀（美國AB公司）。

1.3 PCR擴(kuò)增和STR基因座分型

采用Chelex-100法提取血樣DNA[9]。對(duì)Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng) 20A、25A、22NC、20Y、17X和AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒分別進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3500xL基因分析儀進(jìn)行電泳測序，以試劑盒中相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（ladder）為基因分型參照，采用GeneMapperTMID-X v1.3軟件（美國AB公司）進(jìn)行STR基因座分型。對(duì)經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、25A檢測存在等位基因丟失的案例進(jìn)行樣本測序，由基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司提供技術(shù)支持。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)273份無關(guān)個(gè)體21個(gè)常染色體STR基因座采用Cervus 3.0和Power Stats V12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算21個(gè)STR基因座的等位基因頻率、匹配概率（Pm）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）、非父排除率（PE）、累積非父排除率（CPE），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。本研究案例中父權(quán)指數(shù)（PI）和累積父權(quán)指數(shù)（CPI）的計(jì)算參照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（SF/Z JD0105001—2016），基因突變率男性采用0.002 0，女性采用 0.000 5[2]；D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E 共 19 個(gè)基因座等位基因頻率采用文獻(xiàn)[3]的數(shù)據(jù)，D22S1045基因座等位基因頻率采用文獻(xiàn)[10]的數(shù)據(jù)，其他20個(gè)基因座（D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500）等位基因頻率采用文獻(xiàn)[11]的數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 21個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)

山東漢族人群273份無關(guān)個(gè)體21個(gè)常染色體STR基因座的等位基因頻率見表1，群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2。共得到225個(gè)等位基因，通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，除D4S2366和D2S441基因座外，其他19個(gè)STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。21個(gè)常染色體STR基因座的CPE為0.9999999979，CDP為 0.9999999999。

表1 山東漢族人群21個(gè)常染色體STR基因座的等位基因頻率分布 （n=273）

續(xù)表1

表2 山東漢族人群21個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=273）

2.2 突變案例分析

如表3所示，突變案例1為三聯(lián)體鑒定，被檢父與孩子存在2個(gè)基因座的基因突變，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A以及40個(gè)常染色體STR基因座檢測，CPI值均＞10 000。如作為父女二聯(lián)體鑒定，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測CPI值為5.218 4，增加到40個(gè)STR基因座檢測，CPI值為6.386 8×106，孩子的X-STR分型均可在父母雙方找到其生物學(xué)來源。

突變案例2～5，被檢母或被檢父與孩子存在一個(gè)基因座的基因突變，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A 檢測的 CPI值：0.0001＜CPI＜10000。增加到 40 個(gè)STR基因座檢測，CPI值＞10000，孩子的X-STR或YSTR分型均可在其母親或父親找到其生物學(xué)來源。

突變案例6，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測時(shí)，孩子的D19S433和CSF1PO基因座的分型在被檢父找不到生物學(xué)來源，CPI值為4.811 8×102，而孩子的Y-STR分型與被檢父相同，增加到40個(gè)STR基因座檢測，共有6個(gè)基因座的分型在被檢父找不到生物學(xué)來源，CPI值為5.1690×10-10。孩子與父親可能來自同一父系，通過常染色體STR分型，可排除被檢父是孩子的生物學(xué)父親。

表3 存在基因突變可能的案例

2.3 等位基因丟失案例分析

表4匯總了3例經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A分型并通過AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒確認(rèn)存在等位基因丟失的案例，其中案例1～2經(jīng)過基因測序分析，案例3未進(jìn)行測序分析。

案例1，在D18S51基因座，被檢母及孩子上游引物結(jié)合區(qū)5′端起第8個(gè)堿基由G突變?yōu)锳，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A的相應(yīng)引物無法結(jié)合，導(dǎo)致等位基因19無法檢出。案例2，在D18S51基因座，被檢母及孩子下游引物3′端的四個(gè)堿基AAAC丟失，而引物的3′端恰巧最后一個(gè)堿基與丟失后的相鄰堿基C不匹配，Taq酶無法有效延伸，導(dǎo)致等位基因12無法檢出。

表4 Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A檢測存在等位基因丟失的案例

3 討 論

親權(quán)鑒定試劑盒均包含13個(gè)核心常染色體STR基因座[12-13]，同時(shí)需滿足CDP和CPE均大于0.9999。在不同地區(qū)、不同民族，常染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性存在一定差異，從而對(duì)鑒定案件數(shù)據(jù)的分析帶來一定的影響。本研究統(tǒng)計(jì)了山東漢族人群21個(gè)常染色體STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，其中，D7S3048多態(tài)性最高，D4S2366多態(tài)性最低；DP 為 0.8895～0.9678，PIC 為 0.6903～0.8572，PE 為 0.3786～0.7530，CPE 為0.9999999979，CDP 為 0.9999999999，說明該 21 個(gè)常染色體STR基因座在山東漢族人群中具有較高的遺傳多態(tài)性。與前期研究[3]統(tǒng)計(jì)的19個(gè)常染色體STR基因座聯(lián)合共40個(gè)STR基因座，基本滿足日常檢案鑒定的要求。通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，D4S2366和 D2S441 不符合 Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），可能與樣本的采集及數(shù)量等因素有關(guān)[14]。

常染色體STR基因座平均突變率為0．012 0%～0．2078%，且大部分為一步突變，二步、三步突變相對(duì)較少[15-16]。鑒定案件中存在單個(gè)或兩個(gè)基因座的突變對(duì)鑒定意見的出具影響很大[17]。在父-母-子的三聯(lián)體親權(quán)鑒定中，由于有親生母親的遺傳背景，存在突變情況下還比較容易出具鑒定意見。如突變案例1中，父女存在兩個(gè)基因座的基因突變：三聯(lián)體鑒定時(shí)，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測的CPI值為3.7519×104；而父女二聯(lián)體鑒定時(shí)，CPI值為 5.218 4，當(dāng)增加到40個(gè)STR基因座時(shí)，CPI值為6.3868×106。在突變案例2～5的二聯(lián)體鑒定案例中，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A檢測的CPI值均達(dá)不到10000，而增加到40個(gè)STR基因座時(shí)才能出具支持的鑒定意見。因此，出現(xiàn)基因突變時(shí)，二聯(lián)體親權(quán)鑒定對(duì)檢測的常染色體STR基因座數(shù)目要比三聯(lián)體親權(quán)鑒定要求多。

目前，X和Y染色體STR基因座檢測對(duì)常染色體檢測試劑盒可起到補(bǔ)充作用。出現(xiàn)基因突變時(shí)，在了解案例中相關(guān)人員的遺傳背景前提下，建議增加X-STR或Y-STR的檢測，從而保障鑒定意見的準(zhǔn)確性，但不能作為鑒定意見的唯一依據(jù)。突變案例1～5均增加了X或Y染色體STR基因座，孩子的X-STR或Y-STR分型均可在其被檢父或被檢母找到生物學(xué)來源，符合母系或父系遺傳規(guī)律。而在突變案件6中，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A中共有兩個(gè)基因座存在可能的突變，CPI值為4.811 8×102，當(dāng)增加到40個(gè)STR基因座檢測時(shí)，孩子共有6個(gè)STR基因座的分型結(jié)果在被檢父找不到其生物學(xué)來源，CPI值為5.1690×10-10。雖然孩子的Y-STR基因座分型與被檢父相同，說明被檢父與孩子可能來自同一父系，但不是孩子的生物學(xué)父親。

在日常檢案中，個(gè)別STR基因座分型出現(xiàn)等位基因的丟失或分型結(jié)果不一致[7-8，18]。本研究發(fā)現(xiàn)3例經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A和25A分析，在一個(gè)基因座上被檢母和孩子的基因分型存在很大差異，可能存在等位基因的丟失，用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒檢測進(jìn)行了確認(rèn)。其中2例經(jīng)基因測序分析，在相應(yīng)的引物結(jié)合區(qū)被檢母和孩子存在堿基的突變或丟失，導(dǎo)致相應(yīng)基因座等位基因丟失。如重新設(shè)計(jì)PCR引物，避開有問題的堿基位置，可有效解決等位基因丟失現(xiàn)象[19]，也可以先用不同公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測來解決[19-20]。目前，這種等位基因的丟失現(xiàn)象已引起法醫(yī)學(xué)鑒定領(lǐng)域的關(guān)注[21-22]。

綜上所述，本研究提供了山東漢族人群21個(gè)STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。對(duì)部分存在基因突變的二聯(lián)體鑒定案例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A中的23個(gè)常染色體STR基因座并不能完全滿足二聯(lián)體鑒定要求，存在基因突變時(shí)，建議增加更多的常染色體STR基因座，在了解遺傳背景前提下，同時(shí)增加X-STR或Y-STR檢測系統(tǒng)作為補(bǔ)充。對(duì)存在等位基因丟失的案例，改用不同公司的試劑盒或進(jìn)行基因測序可以有效解決。