石 瑀，尚雋博，羅珮云，李凌睿，趙 宇，劉宇萱，王保捷，姚 軍,*

（1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110122；2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床三系，沈陽(yáng) 110122）

性侵犯罪在刑事案件中的占比呈逐年增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，根據(jù)《2019年中國(guó)性侵司法案件大數(shù)據(jù)報(bào)告》，2017年審結(jié)的強(qiáng)奸案數(shù)量為2 881例，幾近2014年的兩倍。該類(lèi)犯罪社會(huì)危害性大，對(duì)受害者會(huì)造成長(zhǎng)期的身心傷害。因此，迅速、準(zhǔn)確地偵破該類(lèi)案件對(duì)警示不法分子、維護(hù)社會(huì)正常秩序具有重要作用。在此類(lèi)案件中，常見(jiàn)的生物檢材包括陰道/陰莖拭子、內(nèi)褲、床單、衛(wèi)生紙、安全套等，這些檢材多為含精子細(xì)胞和女性上皮細(xì)胞的混合物。在法醫(yī)物證學(xué)中，包含兩名或以上個(gè)體的混合生物檢材稱(chēng)為混合斑（mixed stain）。對(duì)于精陰混合斑，可通過(guò)檢驗(yàn)精液和陰道液中的特殊成分進(jìn)行確證。近年，精液斑的確證試驗(yàn)發(fā)展較快，有很多方法，但主要有兩種，即精子檢出法和免疫學(xué)試驗(yàn)法。而對(duì)于陰道液的確證，當(dāng)前常用細(xì)胞學(xué)檢查和陰道肽酶測(cè)定兩種方法。此外，基于細(xì)胞和組織特異性的mRNA、microRNA、DNA甲基化標(biāo)記等進(jìn)行精陰混合斑的確證研究也取得了一定進(jìn)展，為微量、陳舊性疑難精斑檢材的鑒定提供了新途徑[1]。然而，如何準(zhǔn)確、高效地分離精陰混合斑中的精子細(xì)胞，并盡量避免女性上皮細(xì)胞成分的干擾是處理此類(lèi)檢材的關(guān)鍵，對(duì)于案件定性和證據(jù)價(jià)值發(fā)揮具有至關(guān)重要的作用。但多數(shù)情況下，這類(lèi)混合斑中女性個(gè)體上皮細(xì)胞含量高，而精子細(xì)胞卻相對(duì)較少，并且由于部分精陰混合斑附著的載體具有較強(qiáng)的粘附性，造成洗脫效率低，采用常規(guī)差異提取法對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行分離檢驗(yàn)往往非常困難，有時(shí)即使獲得了分型結(jié)果，也表現(xiàn)為多組分并存的混合分型[2]，難以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和利用。針對(duì)精陰混合斑開(kāi)發(fā)了許多分離檢驗(yàn)技術(shù)，也有很多文獻(xiàn)對(duì)其做過(guò)綜合報(bào)道。本文著重從細(xì)胞和DNA兩個(gè)層面進(jìn)行綜述，梳理有關(guān)文獻(xiàn)、重點(diǎn)闡述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展。

1 精陰混合斑細(xì)胞分離方法

1.1 差異裂解法

差異裂解法（different extraction）或稱(chēng)兩步消化法（two-step lysis），于1985年由Gill等[3]提出。該方法利用精子細(xì)胞與陰道上皮細(xì)胞核表面的差異，將精陰混合斑檢材分兩步消化，從而獲取純的精子細(xì)胞DNA[4]。該法成本低、操作簡(jiǎn)單，至今仍是國(guó)內(nèi)外大部分鑒定機(jī)構(gòu)及實(shí)驗(yàn)室分離精陰混合斑的主要方法。然而，常規(guī)的差異裂解法分離效率較低，對(duì)于某些微量、陳舊性的檢材或精陰混合斑中精子細(xì)胞含量相對(duì)較少的檢材，常會(huì)造成消化不完全或過(guò)度消化的情況，使精子細(xì)胞DNA損失，導(dǎo)致STR分型失敗。

近年來(lái)，許多研究者就其分離效率低等因素，對(duì)差異裂解法不斷進(jìn)行了改良。2014年，Lounsbury等[5]通過(guò)改變第一次溫育時(shí)緩沖液的條件（增加緩沖液pH等），提升了精子細(xì)胞回收率；2017年，馬駿等[6]提出并建立尼龍膜套管技術(shù)，根據(jù)精陰細(xì)胞物理性狀差異以及分子篩的原理，將差異裂解法中第一次消化后所得的混合液利用尼龍膜套管分離精子細(xì)胞，該技術(shù)所需尼龍膜套管價(jià)格相對(duì)便宜，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，可將精陰混合斑中精子細(xì)胞和女性上皮細(xì)胞有效分離，減少了精子細(xì)胞的損失，特別適用于男女物質(zhì)比例懸殊、常規(guī)差異裂解法難以消化完全的精陰混合斑，有很好的應(yīng)用價(jià)值；2018年，Timken等[7]在原有基礎(chǔ)上增加“試管轉(zhuǎn)移”步驟，即將重新懸浮的精子沉淀移至新試管中，再進(jìn)行第二次溫和裂解和隨后的洗滌，大大提升了精子細(xì)胞的DNA純度；2020年，趙凱等[8]發(fā)現(xiàn)在差異裂解法中利用硅珠提取方法，能獲得良好的靈敏度及抗抑制能力，效果優(yōu)于免疫磁珠法，并可廣泛適用于各種法醫(yī)檢材；2020年，Kim等[9]使用蘇木精（0.03%，體積分?jǐn)?shù)）對(duì)精子細(xì)胞染色，通過(guò)差異提取過(guò)程觀察染色的細(xì)胞，減少了多個(gè)洗滌步驟導(dǎo)致的精細(xì)胞損失；2020年，何佳烘等[10]報(bào)道，在前期處理混合斑時(shí)增加純化和二次消化步驟，對(duì)于混有女性陰道血或男女物質(zhì)比例懸殊的檢材，除去女性血液成分后，經(jīng)洗滌可使細(xì)胞碎片與精子沉淀分開(kāi)，能減少精陰混合斑中精子的損失，大大增加精子細(xì)胞分離的成功率。

為使差異裂解法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化，節(jié)省人力并避免與含有SDS等毒性有機(jī)物的消化液直接接觸，不少研究者利用機(jī)器人等技術(shù)對(duì)差異裂解法做出改進(jìn)以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化：2019年，Timken等[11]通過(guò)使用Hamilton AutoLys STAR系統(tǒng)對(duì)差異裂解法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，該系統(tǒng)配備有方法所需的溫育、振蕩和離心等步驟的相關(guān)組件，能實(shí)現(xiàn)上述步驟的完全自動(dòng)化，經(jīng)與手動(dòng)操作對(duì)比，證明該法具有可行性；2020年，Goldstein等[12]通過(guò)QIAcube自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了差異裂解法的自動(dòng)化，降低了下游混合物的干擾，提高了STR配置文件的質(zhì)量，顯著減少了動(dòng)手時(shí)間。

1.2 顯微捕獲法

1.2.1 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection，LCM）是一種可以分離單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同形態(tài)細(xì)胞的分離檢驗(yàn)。單純LCM通過(guò)在組織切片上覆蓋一層透明的熱塑膜，根據(jù)精陰細(xì)胞的形態(tài)差異，利用激光經(jīng)顯微鏡直觀自動(dòng)地從檢材中捕獲單細(xì)胞亞群或單個(gè)細(xì)胞[13]，從而實(shí)現(xiàn)精陰混合斑的分離檢驗(yàn)。該技術(shù)針對(duì)性極強(qiáng)，能從復(fù)雜的精陰混合斑檢材中快速、準(zhǔn)確地獲得微量的精子細(xì)胞，較傳統(tǒng)的差異裂解法在洗脫過(guò)程中損失掉的精子細(xì)胞更少[14]。但是對(duì)于男女物質(zhì)比例懸殊或精子細(xì)胞形態(tài)難以辨認(rèn)的陳舊性檢材[15]，無(wú)法準(zhǔn)確地分離出精子細(xì)胞。此外，由于LCM對(duì)設(shè)備要求較高，其也不便于在基層大規(guī)模普及。

2011年，Axler-DiPerte等[16]將LCM與免疫熒光染色技術(shù)結(jié)合進(jìn)行精子細(xì)胞分離，通過(guò)將熒光染料核固定并與針對(duì)精子細(xì)胞的特異性抗體偶聯(lián)，對(duì)混合斑中的精子細(xì)胞進(jìn)行HYLiterTM免疫熒光染色后，在直觀顯微鏡下辨認(rèn)染色后的精子細(xì)胞并標(biāo)記；2014年，楊帆等[17]把LCM與FISH相結(jié)合，利用X、Y染色體相對(duì)應(yīng)的特異性熒光探針，將X、Y染色體分別染成紅色和綠色，在觀察熒光信號(hào)時(shí)，先使用藍(lán)色熒光使細(xì)胞核輪廓清晰可見(jiàn)，定位后再調(diào)至紅綠色熒光，能夠快速定位細(xì)胞的位置。上述兩種方法，均適用熒光標(biāo)記定位細(xì)胞位置，可以達(dá)到分離細(xì)胞的目的，能大大提高細(xì)胞的識(shí)別效率，且FISH能清晰地分辨陰道上皮細(xì)胞和精子細(xì)胞，便于精子細(xì)胞的識(shí)別，而對(duì)于精子細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則的檢材，這種方法的優(yōu)勢(shì)就更明顯。

1.2.2 顯微操作法

顯微操作法更多運(yùn)用于生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)indlay等[18]于1997年首次利用顯微操作法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分離檢驗(yàn)。該技術(shù)通過(guò)顯微操作儀，在不同倍鏡下調(diào)節(jié)吸吐旋鈕，利用顯微操作儀吸針將懸液中的精子細(xì)胞轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增液面，并對(duì)精子細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)[19]，從而可成功地從精陰混合斑中分離出精子細(xì)胞。該法優(yōu)點(diǎn)在于可直接獲取精陰混合斑中的精子細(xì)胞，減少模板損失，提高分型成功率，節(jié)省檢材，對(duì)精陰混合斑中微量精子的檢驗(yàn)效果較好。2011年，黃江平等[20]采用單細(xì)胞顯微捕獲聯(lián)合低體積擴(kuò)增技術(shù)，很好地分離了混合上皮細(xì)胞，有效解決了混合上皮細(xì)胞的分型問(wèn)題；此外，由于低體積擴(kuò)增體系的體積減小，節(jié)省了試劑，半球狀的密閉空間提供了最佳的微反應(yīng)環(huán)境，也提高了PCR反應(yīng)的靈敏度。但是該法儀器設(shè)備要求高，檢驗(yàn)速度慢，對(duì)人員操作能力要求高，且單一精子DNA檢驗(yàn)會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)擴(kuò)增問(wèn)題，影響準(zhǔn)確性，需要多次重復(fù)操作進(jìn)行綜合研判。

1.3 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)（microfluidic chip）是把生物學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程集成到一塊芯片上，該芯片內(nèi)部至少要有一尺度為微米甚至納米的結(jié)構(gòu)，能夠自動(dòng)完成實(shí)驗(yàn)及分析的全過(guò)程[21]。細(xì)胞捕獲或分離區(qū)域和反應(yīng)檢測(cè)區(qū)是芯片的主要功能區(qū)，同時(shí)也是不同微型芯片的關(guān)鍵和特色區(qū)域[21]，可滿足不同的需求。該技術(shù)通過(guò)將精陰細(xì)胞混合液注射至微型芯片中，在特定區(qū)域根據(jù)不同的功能及特點(diǎn)，將細(xì)胞混合液中的精子細(xì)胞進(jìn)行分離。該法優(yōu)點(diǎn)在于其上樣體積小、檢測(cè)結(jié)果單個(gè)周期短，能夠有效節(jié)省檢材與試劑，可快速檢測(cè)，耗時(shí)少。同時(shí)，該法適用于自動(dòng)化檢測(cè)并能實(shí)現(xiàn)精子細(xì)胞的微觀操控和精確分析。

2009年，Norris等[22]根據(jù)聲波差異提取的原理，通過(guò)微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)精陰細(xì)胞的分離，創(chuàng)立了聲波差異提取法。2015年，Liu等[23]基于精陰細(xì)胞的大小及流體動(dòng)力學(xué)上的差異制造了一種微型芯片，大大提高了精子細(xì)胞DNA的分離效率。2018年，Inci等[24]利用微流控與Sialyl-LewisX寡糖序列結(jié)合，將精子細(xì)胞DNA的分離測(cè)定時(shí)間從原先的8 h減少到8 min，大大提高了精子分離的捕獲效率。2020年，Deshmukh等[25]將微流控芯片與手機(jī)成像系統(tǒng)相結(jié)合，通過(guò)精陰細(xì)胞之間的形態(tài)差異，利用代碼，實(shí)現(xiàn)二者分離，以期達(dá)到精子細(xì)胞DNA提取的目的。此外，還有研究者以微流控芯片為基礎(chǔ)，利用精陰細(xì)胞導(dǎo)電性及形狀不同，通過(guò)雙向電泳[26]的方法分離出精陰混合斑中的精子細(xì)胞。但是，微流控芯片技術(shù)是一項(xiàng)新興技術(shù)，其芯片的集成化、商品化程度還不高，技術(shù)也有待完善可靠，現(xiàn)尚沒(méi)有成熟的芯片產(chǎn)品面世。

1.4 孔徑過(guò)濾法

該方法根據(jù)精陰細(xì)胞形態(tài)學(xué)大小差異即陰道上皮細(xì)胞直徑（40～60 μm）遠(yuǎn)大于精子細(xì)胞直徑（約6 μm），將精陰混合液通過(guò)不同孔徑的過(guò)濾網(wǎng)多次過(guò)濾，從而分離出精陰混合斑中的精子細(xì)胞。其利用成熟的過(guò)濾技術(shù)對(duì)精陰混合斑中的精子細(xì)胞進(jìn)行分離富集，較差異裂解法分離速度快、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)驗(yàn)要求不高、可實(shí)現(xiàn)精陰混合斑的快速分離檢驗(yàn)。但是目前仍?xún)H適用于常量的精陰混合斑檢材。

2018年，朱典等[27]通過(guò)對(duì)其發(fā)明的一種人體脫落上皮細(xì)胞濾器[28]作改良，利用不同孔徑的尼龍網(wǎng)格膜制作濾網(wǎng)，采用二重過(guò)濾的方法，快速分離并檢驗(yàn)精子細(xì)胞，在數(shù)起案件檢驗(yàn)中取得了良好的效果，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1.5 免疫磁珠法

磁性分離技術(shù)其工業(yè)應(yīng)用已有很長(zhǎng)的歷史。1979年Ugelstad等首次將該技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。近年來(lái)該技術(shù)也開(kāi)始運(yùn)用于法醫(yī)精陰混合斑中精子細(xì)胞的分離[29]，該技術(shù)通過(guò)制備與精子細(xì)胞表面特異性抗原相對(duì)應(yīng)的抗體，偶聯(lián)磁珠形成免疫磁珠，再使其與混合檢材中的精子細(xì)胞形成磁珠-抗體-精子細(xì)胞復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)作用下就可實(shí)現(xiàn)定向捕獲并分離出精子細(xì)胞。

精子細(xì)胞的表面特異性抗原種類(lèi)較多。2002年，Eisenberg等[30]根據(jù)精子細(xì)胞表面的3種特異性抗原制備免疫磁珠，成功分離出了精陰混合斑中的精子細(xì)胞；2007年，Anslinger等[31]篩選出3種抗血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體并制備成免疫磁珠，實(shí)現(xiàn)了精陰混合斑中精子細(xì)胞的分離，擴(kuò)大了免疫磁珠的選擇范圍；2011年，趙興春等[32]利用抗人精子魚(yú)精蛋白抗體和抗-SPAG8抗體構(gòu)建免疫磁珠，制作特異性定向捕獲復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)了精子細(xì)胞定向富集和分離，初步建立了捕獲試劑體系；2015年，李學(xué)博等[33]發(fā)現(xiàn)MOSPD3抗體、SPAG8抗體均可以運(yùn)用于免疫磁珠技術(shù)特異性分離精陰混合斑中的精子細(xì)胞。此外，在一些輪奸案件中，常會(huì)混合多名男性的精子細(xì)胞。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同血型男性的精子細(xì)胞表面會(huì)有不同的ABO特異性抗原，據(jù)此選擇與之相對(duì)應(yīng)的特異性抗原，采用免疫磁珠法分離精子細(xì)胞的同時(shí)，可對(duì)不同男性的精子細(xì)胞進(jìn)行分離。2016年，Xu等[34]通過(guò)將免疫磁珠法和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，成功地將兩名不同ABO血型的嫌疑人的精子細(xì)胞DNA分離。該類(lèi)抗原的發(fā)現(xiàn)，為日后從精陰混合斑鑒定出兩名及以上男性精子DNA提供了借鑒。目前，發(fā)現(xiàn)的精子特異性抗原已達(dá)100多種，制備免疫磁珠的方法也有多種，這些將有利于該技術(shù)的方法學(xué)研究和優(yōu)化[33]。

免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，分離快速，使用安全，所需實(shí)驗(yàn)器材和儀器價(jià)格相對(duì)便宜，可在基層鑒定機(jī)構(gòu)和公安局普及。對(duì)于多人實(shí)施的性犯罪，該技術(shù)可利用不同ABO血型的男性精子細(xì)胞表面特異性抗原的差異，查明精陰混合斑中不同血型的男性成分來(lái)源。此外，該方法基本不會(huì)對(duì)精子細(xì)胞本身造成破壞，并可同時(shí)進(jìn)行精子細(xì)胞的分離、純化與富集，具有自動(dòng)化檢驗(yàn)的發(fā)展前景。其缺點(diǎn)在于需要對(duì)特異性抗體進(jìn)行篩選，且對(duì)于某些案件，若檢材較為陳舊、精子細(xì)胞表面抗原降解，則很難實(shí)現(xiàn)免疫磁珠與精子細(xì)胞的結(jié)合，此時(shí)就需要結(jié)合實(shí)際情況，借助或運(yùn)用其他技術(shù)完成精子細(xì)胞的分離。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）或稱(chēng)熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS），是一種以流式細(xì)胞儀為核心，可對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速定性、定量分析或分選的技術(shù)。

該技術(shù)經(jīng)對(duì)精陰細(xì)胞混合液中的精子細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，制成單細(xì)胞懸液，通過(guò)流動(dòng)室液流系統(tǒng)、光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)可分別對(duì)精子細(xì)胞實(shí)現(xiàn)樣品聚集、產(chǎn)生光信號(hào)并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。電信號(hào)再通過(guò)計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)就能逐個(gè)、多參數(shù)、快速地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性、定量分析。而后細(xì)胞經(jīng)過(guò)分選區(qū)，利用細(xì)胞膜表面不同的電荷量，通過(guò)分選系統(tǒng)施加的高壓電場(chǎng)，就可完成對(duì)細(xì)胞的分離[35]。

Schoell等[36]通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)分子（MHC I）、細(xì)胞角蛋白和CD45分子在精陰細(xì)胞表面的差異性表達(dá)等特點(diǎn)，采用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)經(jīng)逆向篩選實(shí)現(xiàn)了精陰細(xì)胞分離[37]。但對(duì)陳舊、干燥、降解嚴(yán)重的檢材，該方法會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜表面蛋白的缺失而失效。因此有研究者指出，可將物證提取方法由陰道拭子改為陰道灌洗，以減少轉(zhuǎn)移過(guò)程中對(duì)精子細(xì)胞的損傷，提高分離成功率。

FCM可通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)精子細(xì)胞多參數(shù)的快速定性、定量分析和分選。但是對(duì)于精子細(xì)胞含量極低的檢材以及精子細(xì)胞難以辨認(rèn)的陳舊性檢材，其與LCM有相同的局限性；再者其也要求檢驗(yàn)者應(yīng)具有較高的經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)水平。此外，流式細(xì)胞儀費(fèi)用較高，難以在基層推廣。

上述6種精陰混合斑細(xì)胞的分離技術(shù)與方法各自的技術(shù)特點(diǎn)和使用條件概括于表1。

表1 本文所述精陰混合斑細(xì)胞分離方法比較Table 1 Comparison among methods to separate sperm cells from mixed stains of seminal and vaginal fluid

2 精陰混合斑DNA分型分析方法

精子細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞含有大量DNA，研究者從精子細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞提取DNA，可以通過(guò)不同的遺傳標(biāo)記，獲得DNA的多態(tài)性信息，從而分析細(xì)胞來(lái)源，達(dá)到個(gè)人識(shí)別的目的。

2.1 單一精子來(lái)源的DNA分析

在對(duì)精陰混合斑進(jìn)行細(xì)胞分離后，能夠得到單一來(lái)源的精子細(xì)胞。在提取其DNA后，利用DNA多態(tài)性分型技術(shù)（目前多采用PCR-STR分型技術(shù)[4]），通過(guò)檢測(cè)其DNA多態(tài)性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該精子細(xì)胞的個(gè)體識(shí)別。由于精子細(xì)胞為單倍型，僅分析一個(gè)精子細(xì)胞無(wú)法獲得個(gè)人的完整基因型，故一般需要捕獲7個(gè)以上細(xì)胞才能獲得個(gè)體的完整分型（＞99%），而每個(gè)捕獲樣本還需至少平行檢驗(yàn)兩次以上，以保證每個(gè)精子細(xì)胞均能獲得準(zhǔn)確的分型。

此外，由于Y染色體為男性特有，Y-STR呈男性伴性遺傳，除突變外，父系所有親屬都具有相同的Y-STR單倍型，因此可以利用父系親屬的參考樣本對(duì)犯罪嫌疑人進(jìn)行排除或追蹤。然而，其用于個(gè)人識(shí)別僅具有排除意義，不能認(rèn)定同一。

2.2 精液特異DNA甲基化位點(diǎn)

基因組中特定區(qū)域的甲基化特征具有細(xì)胞或組織特異性，精斑中的DNA也有其自身特異的甲基化特征。依據(jù)DNA甲基化位點(diǎn)構(gòu)建精液特異性SNP分型復(fù)合體系可以特異性地獲得精子SNP位點(diǎn)的分型，對(duì)于精液的鑒定具有重要價(jià)值。但該體系距離實(shí)用尚需時(shí)日，有關(guān)問(wèn)題如通過(guò)管家基因的分型結(jié)果來(lái)判斷陰性結(jié)果的樣本中是否含有生物檢材，進(jìn)行種屬確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否具有人種屬的特異性，以及分析更多體液相關(guān)的甲基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)，補(bǔ)充更多的精液特異性位點(diǎn)使分型更加準(zhǔn)確等[38]，仍需要做大量的工作。

2.3 女性DNA來(lái)源的分析

大多數(shù)情況下，對(duì)強(qiáng)奸案件相關(guān)物證檢驗(yàn)時(shí)，精陰混合斑中女性物質(zhì)DNA的檢測(cè)及其數(shù)據(jù)庫(kù)檢索往往被忽視[39]。然而在一些情況下，“被害人”會(huì)出于某種目的而提供假證。因此在強(qiáng)奸案件中，女性物質(zhì)的認(rèn)定也是有關(guān)物證可作為證據(jù)的前提條件，只有確認(rèn)了其與被害人相關(guān)，檢出的精斑才有意義，并且對(duì)案件定性還會(huì)起到至關(guān)重要的作用。

法醫(yī)實(shí)踐中，常從差異裂解法第一次消化后離心的上清液中提取混合斑女性DNA成分，并對(duì)常染色體進(jìn)行STR多態(tài)性分析以實(shí)現(xiàn)對(duì)女性成分的個(gè)人識(shí)別。

2.4 混合DNA的分型分析

雖然隨著技術(shù)革新，前文所述各種精陰混合斑分離方法一直在不斷改善，精子細(xì)胞的分離率也在不斷提高，但是大多數(shù)情況下，檢材中男女比例懸殊，加之部分精陰混合斑附著載體具有較強(qiáng)的粘附性，最后還是無(wú)法得到單一來(lái)源的DNA。男性和女性個(gè)體在不同遺傳標(biāo)記系統(tǒng)中存在差異，可根據(jù)DNA混合圖譜中的峰高和峰面積來(lái)推測(cè)男性個(gè)體的數(shù)目及在混合斑中的比例，因此，可以通過(guò)檢測(cè)這些遺傳標(biāo)記來(lái)達(dá)到區(qū)分判斷精陰混合DNA分型的目的。該方法是通過(guò)使用男女不同的遺傳標(biāo)記、分型方法以及分析方法，對(duì)精陰混合斑的DNA混合物進(jìn)行分析，以確定其來(lái)源及個(gè)體數(shù)，為案情提供信息。目前使用到的遺傳標(biāo)記有短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、微單倍型（MH）等。

2.4.1 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）

在法醫(yī)DNA分析中，多應(yīng)用常染色體STR和Y染色體STR進(jìn)行DNA分析，其中Y-STR在性犯罪案件中應(yīng)用已非常成熟，近年來(lái)新的Y-STR不斷出現(xiàn)，使得其數(shù)量愈加龐大，且在不同人種差異鑒別上也顯現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[40]。當(dāng)前，常用染色體STR標(biāo)記在法醫(yī)DNA分析中應(yīng)用最為廣泛的是復(fù)合擴(kuò)增法和毛細(xì)管電泳法（CE）。近年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)也有應(yīng)用，而且較傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳STR分型技術(shù)，該技術(shù)既能檢測(cè)STR基因座的長(zhǎng)度多態(tài)性信息，又能分析各基因座序列多態(tài)性信息，通過(guò)分析核心序列和側(cè)翼序列的堿基序列差異，可對(duì)等位基因進(jìn)行精準(zhǔn)分型，故在法醫(yī)物證領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[41]。當(dāng)前，STR-CE分型的個(gè)體識(shí)別框架已建立較完備，STR也是當(dāng)今法醫(yī)DNA分析的主流。在刑事偵查中，法醫(yī)可將犯罪現(xiàn)場(chǎng)獲得的STR與數(shù)據(jù)庫(kù)中的進(jìn)行比對(duì)，如有匹配，就將利于調(diào)查進(jìn)一步進(jìn)行[40]。

STR標(biāo)記仍有一定的局限性，其雖然可以很好地分析兩個(gè)人的DNA混合物，但是不適合于復(fù)雜的混合物分析，且混合物中目標(biāo)DNA至少要占DNA總量的5%～10%時(shí)才能做出分析，否則就會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)擴(kuò)增效應(yīng)、隨機(jī)抽樣變異等導(dǎo)致片段丟失。此外，STR標(biāo)記也不能很好地適用于降解DNA的分析。

近年來(lái)，有不少研究者在對(duì)STR標(biāo)記方法進(jìn)行改良：

1）將其他類(lèi)型的遺傳標(biāo)記與STR相結(jié)合，如SNP-STR、DIP-STR等，以求極大程度地在不平衡混合DNA中靶向檢測(cè)出次要成分DNA，例如在2018年，Tan等[42]使用11種新的SNP-STR標(biāo)記，通過(guò)ARMS進(jìn)行基因分型，實(shí)現(xiàn)了次要貢獻(xiàn)者的DNA在1∶100的混合樣本中得到成功分型。

2）DNA混合物的定量分析解釋?zhuān)梢苑治?人以上、5人以下的DNA混合物，當(dāng)前主要有半連續(xù)（定性）模型和全連續(xù)（定量）模型兩種方法，其中，半連續(xù)模型僅能利用定性信息，而連續(xù)模型能夠充分利用包括定性信息的分型結(jié)果。2011年，第一個(gè)連續(xù)軟件TrueAlleleò獲得驗(yàn)證，并隨后在英國(guó)和美國(guó)的法院得到應(yīng)用，其他如STRmix?的連續(xù)軟件，也有驗(yàn)證和應(yīng)用[40]。2016年，第一個(gè)開(kāi)源連續(xù)模型軟件EuroForMix發(fā)布。然而通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究與實(shí)踐應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，全連續(xù)模型不能解決復(fù)雜混合物中存在的少量DNA問(wèn)題，且與半連續(xù)模型相比，連續(xù)模型的算法和計(jì)算相當(dāng)復(fù)雜，在法庭上更難討論，不同連續(xù)軟件的LR一致性要低于半連續(xù)軟件。

在我國(guó)，前期研究主要集中在前期投入少而經(jīng)驗(yàn)要求相對(duì)較高的人工分析領(lǐng)域，相比于較早開(kāi)始DNA檢驗(yàn)的國(guó)外，國(guó)內(nèi)從理論模型研究到系統(tǒng)平臺(tái)搭建都還不成熟，在自動(dòng)化和智能算法方面國(guó)外仍有很多可借鑒之處[43]。在不久的將來(lái)，隨著人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，STR分型技術(shù)將會(huì)趨向自動(dòng)化，可有效擴(kuò)大應(yīng)用范圍并降低使用門(mén)檻，會(huì)有助于從根本上解決混合斑STR分型分析應(yīng)用的難題。

2.4.2 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

當(dāng)前SNP標(biāo)記已運(yùn)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雖然較STR而言，SNP的多態(tài)性低，無(wú)法獲得與STR相同的信息量，這也是SNP的主要限制，但是其更適合于短擴(kuò)增片段的降解DNA或?yàn)?zāi)難受害者識(shí)別，且其突變率較低。此外，SNP標(biāo)記較STR有更多的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

近年來(lái)，一些科學(xué)家提出了一種利用數(shù)千個(gè)雙SNP來(lái)分析復(fù)雜混合物的策略，而不是追求每個(gè)SNP的高雜合子。2011年，Voskoboinik和Darvasi[44]應(yīng)用一種隨機(jī)人不排隊(duì)（random man not excluded,RMNE）的方法，基于數(shù)千個(gè)雙SNP分析復(fù)雜混合物的策略，提出了p（RMNE）的算法：

式中：S是排除位點(diǎn)或錯(cuò)配位點(diǎn)的數(shù)目，p（Ai）是位點(diǎn)i的主等位基因頻率。p（RMNE）越小，被懷疑是混合物貢獻(xiàn)者的機(jī)會(huì)越小。一般來(lái)說(shuō)，p（RMNE）＜10-9。

有學(xué)者提出，可以通過(guò)增加SNP的位點(diǎn)數(shù)量來(lái)提高DNA混合物的鑒別力，但是此舉會(huì)暴露個(gè)體過(guò)多的DNA信息，造成侵犯隱私。但無(wú)論如何，其在降解DNA分析方面的優(yōu)勢(shì)是無(wú)可爭(zhēng)議的，隨著檢測(cè)與測(cè)序技術(shù)的成熟，其有潛力服務(wù)于各種法醫(yī)學(xué)目的[40]。

2.4.3 微單倍型（MH）

MH作為一種新引入的遺傳標(biāo)記，已成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其最早由Kidd等[45]于2013年提出，為在小于300 bp的DNA區(qū)段內(nèi)、包含2個(gè)SNP的多態(tài)性位點(diǎn)。在300 bp DNA片段長(zhǎng)度范圍內(nèi)，微單倍型內(nèi)部SNP間的重組率幾乎為0。一個(gè)微單倍型位點(diǎn)可視作一個(gè)獨(dú)立基因庫(kù)，其多態(tài)性由SNP的特定組合所構(gòu)成[46]。

MH標(biāo)記的特點(diǎn)在于其突變率低，長(zhǎng)度短，更適合于降解DNA的分析，在突破STR標(biāo)記局限性的同時(shí)，又承載有SNP標(biāo)記的所有優(yōu)點(diǎn)，且能較大程度地發(fā)揮測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)分析中的優(yōu)勢(shì)。此外，MH標(biāo)記通過(guò)定義幾個(gè)鏈接SNP作為一個(gè)單一的位點(diǎn)，可以減少無(wú)用信息DNA片段的測(cè)序，避免侵犯隱私。然而，由于作為一種新引入的遺傳標(biāo)記，MH標(biāo)記的群體遺傳數(shù)據(jù)相對(duì)缺乏，檢測(cè)成本也相對(duì)較高，另外，位點(diǎn)篩選條件也還有待提高。但值得肯定的是，MH標(biāo)記將會(huì)是一個(gè)非常有前途和通用性的工具，在未來(lái)，將會(huì)被更廣泛地運(yùn)用于精陰混合斑分析以及其他法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)已開(kāi)發(fā)的各項(xiàng)技術(shù)，結(jié)合精子細(xì)胞及其DNA的多種特異性，建立了許多精陰混合斑分離檢驗(yàn)技術(shù)，并一直在不斷改良。但所有技術(shù)與方法主要還是通過(guò)細(xì)胞水平的分離以及DNA水平的分型分析實(shí)現(xiàn)對(duì)精陰混合斑的分離檢驗(yàn)。

在細(xì)胞水平，差異裂解法作為一種傳統(tǒng)的精陰混合斑分離技術(shù)，現(xiàn)仍被廣泛應(yīng)用，且研究者也在不斷地對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，如本文提到的國(guó)內(nèi)學(xué)者研發(fā)并應(yīng)用的尼龍膜套管法，國(guó)外學(xué)者利用機(jī)器人技術(shù)所做出的革新，前者能大大提高差異裂解法的分離效率，后者則可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。另外，其他新技術(shù)也不斷被關(guān)注和應(yīng)用，如微流控芯片技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)準(zhǔn)確率高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，均有較好的發(fā)展前景，免疫磁珠法更是可在基層鑒定機(jī)構(gòu)和公安機(jī)關(guān)逐漸普及。在DNA水平，從精陰混合斑中分離出精陰細(xì)胞并分別提取DNA，獲得DNA多態(tài)性分型，就可判斷混合斑中各成分的來(lái)源。同時(shí)，由于精液中的特有成分，如精子特異的DNA甲基化位點(diǎn)，法醫(yī)研究人員可通過(guò)直接檢測(cè)這些位點(diǎn)判斷精液的來(lái)源。然而，由于現(xiàn)今精陰混合斑的分離方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)精子細(xì)胞的精準(zhǔn)完全捕獲，故很多時(shí)候就無(wú)法獲得單一來(lái)源的DNA，此時(shí)或可通過(guò)不同的遺傳標(biāo)記，對(duì)精陰混合斑的DNA混合物進(jìn)行分析，以確定其來(lái)源。當(dāng)前，STR標(biāo)記檢驗(yàn)鑒定仍是法醫(yī)DNA分析主要且必用的方法，許多國(guó)家都建立了STR國(guó)家DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，依據(jù)檢材條件并結(jié)合案情，其他遺傳標(biāo)記亦或可調(diào)用或幫助分析，其中，MH標(biāo)記法可較大程度發(fā)揮測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)分析中的優(yōu)勢(shì)，有很好的前途和較高的通用性。

誠(chéng)然，現(xiàn)在仍缺乏一種簡(jiǎn)單、快速、高效、安全并能廣泛普及適用的精陰混合斑分離檢驗(yàn)技術(shù)。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，未來(lái)會(huì)有更多新興技術(shù)應(yīng)用于精陰混合斑處理，精陰混合斑分離檢驗(yàn)技術(shù)會(huì)更多、更具實(shí)用性，性犯罪案件中精陰混合斑的分離檢驗(yàn)將不再是一個(gè)難題。