丁一

摘要：水體富營養(yǎng)化，藻類爆發(fā)是我國湖庫亟待解決的主要水質(zhì)問題之一，作為藻類生長的主要營養(yǎng)鹽和制約因素，磷是水體富營養(yǎng)化的限制性誘因。在磷的代謝轉(zhuǎn)化過程中，多聚磷酸鹽（Poly-P）可將眾多無機(jī)磷酸鹽單體聚合。磷酸激酶（PPK）與Poly-P代謝密切相關(guān)。因此，對(duì)磷酸激酶基因PPK進(jìn)行研究十分必要。

Abstract： Eutrophication is one of the main water quality problems for lakes and reservoirs in China. As the main nutrients of algae， the input of phosphorus is the main inducement of eutrophication. Polyphosphate （Poly-P） can polymerize many inorganic phosphate monomers in the process of phosphorus metabolism. Therefore， it is very necessary to study the PPK gene which is closely related to Poly-P metabolism.

關(guān)鍵詞：磷酸激酶基因;缺失;克隆;除磷;環(huán)境因素

Key words： phosphokinase gene;missing;cloning;phosphorus removal;environmental factors

中圖分類號(hào)：X703? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1006-4311（2020）02-0270-02

0? 引言

水體富營養(yǎng)化，藻類爆發(fā)是我國湖庫亟待解決的主要水質(zhì)問題之一。2011年，26個(gè)國控重點(diǎn)湖泊（水庫）中，富營養(yǎng)狀態(tài)占53.8%。富營養(yǎng)化趨勢(shì)逐年增長，作為藻類生長的主要營養(yǎng)鹽和制約因素，磷既是主要污染指標(biāo)，也是水體富營養(yǎng)化的限制性誘因。水體中磷含量增加，藻類將大量繁殖，影響湖庫生態(tài)平衡、威脅人體健康和社會(huì)穩(wěn)定。控制水中磷含量是抑制藻類生長，阻止富營養(yǎng)化發(fā)生的重要手段。

微生物可通過其種群結(jié)構(gòu)變化和功能代謝活動(dòng)改變磷的循環(huán)轉(zhuǎn)化，影響上覆水體水質(zhì)。此外，上覆水中的磷素又可憑借自然沉降、季節(jié)性返混等方式傳輸至沉積物，為微生物提供營養(yǎng)，改變其種類、數(shù)量和代謝。所以，微生物既是磷遷移轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，也是湖庫營養(yǎng)元素的儲(chǔ)存庫和反饋者。系統(tǒng)研究微生對(duì)磷循環(huán)轉(zhuǎn)化過程的作用與影響，對(duì)于掌握內(nèi)源磷釋放規(guī)律，抑制磷釋放提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

聚磷酸鹽自從前生物時(shí)代起就已被發(fā)現(xiàn)存在于自然界的生物中，如古細(xì)菌、細(xì)菌、原生菌、真菌、植物和動(dòng)物。多聚磷酸鹽在微生物中可占細(xì)胞干重的10%，在三磷酸腺苷（ATP）發(fā)現(xiàn)之前，被認(rèn)為是能量的分配者。線狀或環(huán)狀多聚物多聚磷酸鹽是由激酶催化的高能供體上的磷酸鹽殘基向Poly-P鏈上轉(zhuǎn)化反應(yīng)而形成，將多個(gè)無機(jī)磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合。PPK與Poly-P代謝密切相關(guān)，通過催化ATP末端磷酸基團(tuán)可逆地轉(zhuǎn)移到長鏈Poly-P上，形成長度一千甚至更長的正磷酸鹽線狀或環(huán)狀多聚物。PPK是生物累積利用環(huán)境中磷酸鹽生成多聚磷酸鹽的催化劑。許多自然微生物本身即具有聚集磷的能力，但作用效果有限。大量文獻(xiàn)表明，PPK基因過度表達(dá)的微生物能過量的吸收環(huán)境中的磷酸鹽，環(huán)境中的磷就會(huì)降低或去除。工程菌除磷能力較野生型大大提高，細(xì)胞也能更廣泛的聚磷。因此，探明細(xì)菌磷酸鹽轉(zhuǎn)化、代謝生化機(jī)制和遺傳特征，有助于提高聚磷菌從水中去除磷酸鹽能力。

1? 多聚磷酸鹽分類

在PPK家族中包含多種子族，PPK1在細(xì)菌中非常保守，最初由大腸桿菌分離出來，催化ATP末端的磷合成Poly-P的可逆反應(yīng)。但是有時(shí)，在好養(yǎng)異養(yǎng)硝化菌中，PPK1[1]往往只催化Poly-P的合成而不進(jìn)行Poly-P的分解。

PPK2[2]分為三個(gè)子族，I級(jí)和II級(jí)PPK2分別催化二磷酸核苷和一磷酸核苷磷酸化。III級(jí)PPK2可以從AMP和聚磷酸鹽中合成ATP。PPK2聚磷時(shí)可以使用GTP或者ATP作為底物，而PPK1嚴(yán)格使用ATP為底物。在利用Poly-P作為核苷二磷酸的供體時(shí)，PPK2更傾向于GDP而不是ADP。

PPK3[3]是一種使用無機(jī)多聚磷酸鹽作為供體將CDP轉(zhuǎn)化為CTP的酶。在分子量，肽序列相似性，物理性質(zhì)，絲狀結(jié)構(gòu)方面類似于肌動(dòng)蛋白家族。在PPK3突變體中，由于觀察到蛋白質(zhì)降解和膜檢索是不耦合的，推測(cè)PPK3突變體的溶酶體擴(kuò)大是由于成熟溶酶體的膜檢索缺陷所致。這些都顯示了PPK3在發(fā)育和生理功能中具有重要作用。

存在于VCT復(fù)合體中的PPK4參與Poly-P的跨膜運(yùn)輸[4]，如何利用PPK4提高Poly-P的跨膜運(yùn)輸速率也可以作為一個(gè)研究方向。如何整體提高除磷效果，既要考慮微生物的生長活性，也要考慮起主要作用酶的表達(dá)以及磷進(jìn)出細(xì)胞的過程控制，綜合考量，以達(dá)到更好的效果。

由上述PPK家族成員，我們可以看出，PPK1是Poly-P合成的關(guān)鍵基因，其表達(dá)量的高低直接影響聚磷菌聚磷能力的強(qiáng)弱。如何整體提高除磷效果，既要考慮微生物的生長活性，也要考慮起主要作用酶的表達(dá)以及磷進(jìn)出細(xì)胞的過程控制，綜合考量，以達(dá)到更好的效果。

2? PPK對(duì)微生物影響

在一定條件下，多聚磷酸鹽驅(qū)動(dòng)核苷酸磷酸化對(duì)微生物細(xì)胞的生存很重要。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)poly-p水平較低，在應(yīng)對(duì)各種壓力條件下，顯現(xiàn)出生物膜的形成，群體感應(yīng)，運(yùn)動(dòng)性，以及其他毒性屬性的缺陷。Poly-P可增強(qiáng)細(xì)胞抵抗外界惡劣環(huán)境能力，促進(jìn)孢子及生物膜形成，提高捕食能力，增強(qiáng)細(xì)菌毒性等[5]。

PPK1能成為藥物的靶點(diǎn)，在細(xì)菌病原體中，針對(duì)PPK1的表達(dá)，能成為具有潛在的抗菌藥物設(shè)計(jì)目標(biāo)，因?yàn)樗鼫p少了細(xì)菌的毒性和持久性，同時(shí)增加了對(duì)抗生素的敏感性。類鼻疽伯克霍爾德菌PPK突變體在氧化應(yīng)激條件下易受過氧化氫的影響，無法進(jìn)行游泳、聚集運(yùn)動(dòng)，比野生型菌株具有較低密度的生物膜形成能力[6]。研究人員在一些實(shí)驗(yàn)中將PPK基因敲除。在ShuminTan對(duì)幽門菌菌株的研究中，不激活PPK1致使聚磷量較預(yù)期減少超過250倍，幾乎沒有聚磷[7]。管莉菠等人克隆了PPK基因，構(gòu)建多聚磷酸鹽激酶表達(dá)菌株，磷的去除率達(dá)到80%。PPK基因在E.coli中的過量表達(dá)，致使E.coli菌體中Poly-P大量聚集，從而使培養(yǎng)基中的磷酸鹽大量去除[8]。由此，可以看出PPK對(duì)微生物聚磷的重要作用。

3? 自然環(huán)境對(duì)PPK表達(dá)的影響

PPK對(duì)除磷效果影響巨大，除了敲除和克隆，自然環(huán)境條件也會(huì)對(duì)PPK的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而影響聚磷。

研究表明PPK活性隨溫度變化而變化，不具有規(guī)律性。但也有實(shí)驗(yàn)指出隨著溫度的升高，聚磷菌細(xì)胞內(nèi)PPK 的活性持續(xù)增大。在張超等人的研究中，聚磷酸激酶的活性隨著pH的增加而線性增加，并且聚磷菌的產(chǎn)率與聚磷酸鹽激酶活性分別呈線性關(guān)系。在低濃度ZnO NPs作用下，PPK酶活與空白組相差不大。然而，高濃度ZnO NPs作用下，PPK酶活明顯低于空白組。在任世英等人的研究中，碳源豐富，磷酸鹽含量高，聚磷積累，PPK活性好。這說明了PPK活性受多種因素調(diào)節(jié)，單一環(huán)境變化并不一定會(huì)改變PPK活性，顯示出PPK調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

4? 結(jié)束語

在實(shí)際污廢水除磷、水生態(tài)環(huán)境修復(fù)等實(shí)踐中，相對(duì)于PPK的敲除與克隆，改變或者說強(qiáng)化有利的環(huán)境條件更容易實(shí)現(xiàn)，對(duì)于提高水體除磷效果具有更強(qiáng)的可實(shí)際操作性。因此，加強(qiáng)環(huán)境條件變化對(duì)PPK表達(dá)影響方面的研究具有極強(qiáng)的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Trelstad P.L.， Purdhani P.， Geissd？觟rfer W.， et al. Polyphosphate kinase of Acinetobacter sp. strain ADP1： purification and characterization of the enzyme and its role during changes in extracellular phosphate levels[J]. Appl Environ Microbiol， 1999， 65（9）： 3780-3786.

[2]Nocek B.， Kochinyan S.， Proudfoot M.， et al. Polyphosphate-dependent synthesis of ATP and ADP by the family-2 polyphosphate kinases in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 2008 v.105 no.46（no. 46）： pp. 17730-17735.

[3]Gómez-García M.R.， Kornberg A. Formation of an actin-like filament concurrent with the enzymatic synthesis of inorganic polyphosphate[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（45）： 15876-15880.

[4]Hothorn M.， Neumann H.， Lenherr E.D.， et al. Catalytic core of a membrane-associated eukaryotic polyphosphate polymerase[J]. Science， 2009， 324（5926）： 513-516.

[5]Brown M.R.W.， Kornberg A. Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（46）： 16085-16087.

[6]Tunpiboonsak S.， Mongkolrob R.， Kitudomsub K.， et al. Role of a Burkholderia pseudomallei polyphosphate kinase in an oxidative stress response， motilities， and biofilm formation[J]. The Journal of Microbiology， 2010， 48（1）： 63-70.

[7]Tan S.， Fraley C.D.， Zhang M.， et al. Diverse phenotypes resulting from polyphosphate kinase gene （ppk1） inactivation in different strains of Helicobacter pylori[J]. J Bacteriol， 2005， 187（22）： 7687-7695.

[8]管莉菠，蔡天明，李波，等.Pseudomonas putida GM6多聚磷酸鹽激酶（ppk）基因的克隆及表達(dá)[J].土壤學(xué)報(bào)，2007：727-733.