丁書(shū)軍 廖潔 張琛曉 黃麗霞 黃寧 湯旭 余興火

[摘要]目的 探討白英生物堿（STA）對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用。方法 提取STA并制備4.0、8.0、16.0 mg/L等3種濃度的STA反應(yīng)體系，分別定義為反應(yīng)體系A(chǔ)、B、C，設(shè)置空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h后通過(guò)MTT法檢測(cè)各反應(yīng)體系光密度（OD）值和對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制效果。結(jié)果 不同濃度STA反應(yīng)體系的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系C的OD值顯著低于空白對(duì)照、反應(yīng)體系A(chǔ)及B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系B的OD值顯著低于空白對(duì)照和反應(yīng)體系A(chǔ)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系A(chǔ)的OD值顯著低于空白對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度STA反應(yīng)體系的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系C的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于反應(yīng)體系A(chǔ)和B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系B的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于反應(yīng)體系A(chǔ)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 STA對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。

[關(guān)鍵詞]白英生物堿;人宮頸癌HeLa細(xì)胞;細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R711.74? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）8（c）-0034-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of solanumlyratum Thunberg alkaloid （STA） on human cervical cancer HeLa cells. Methods Extraction of STA and preparation of three concentration STA reaction systems 4.0， 8.0， 16.0 mg/L were defined as reaction systems A， B and C， respectively， and the blank control was set. The optical density （OD） value of each reaction system and the inhibitory effect on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells were detected by MTT method after 24 hours of culture. Results The OD values of STA reaction systems at different concentrations were significantly different （P<0.05）. The OD value of reaction system C was significantly lower than that of blank control， reaction system A and B， the differences were statistically significant （P<0.05）. OD value of reaction system B was significantly lower than that of blank control and reaction system A， the differences were statistically significant （P<0.05）. OD value of reaction system A was significantly lower than that of blank control， the difference was statistically significant （P<0.05）. The growth inhibition rates of STA reaction system at different concentrations were significantly different （P<0.05）. The growth inhibition rate of reaction system C was significantly higher than that of reaction system A and B， the differences were statistically significant （P<0.05）. The growth inhibition rate of reaction system B was significantly higher than that of reaction system A， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion STA can inhibit the proliferation of human cervical cancer HeLa cells.

[Key words] Solanumlyratum Thunberg alkaloid; Human cervical cancer HeLa cells; Cell proliferation

白英（Solanumlyratum Thunb），又稱之為白毛藤，屬于茄科植物，臨床上多用于宮頸癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤的治療[1]。流行病學(xué)研究調(diào)查顯示，宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[2-3]，給患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重影響。既往研究認(rèn)為，白英水提物可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株產(chǎn)生抑制作用。韋星等[4]報(bào)道，白英水提物對(duì)HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其分子機(jī)制可能涉及caspase-3基因表達(dá)上調(diào)、survivin基因表達(dá)下調(diào)等。韋星等[5-6]報(bào)道，白英提取液能促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制可能涉及上調(diào)Fas基因、p53蛋白表達(dá)及下調(diào)FasL基因、Bcl-2蛋白表達(dá)等。值得注意的是，白英提取既可以采用無(wú)機(jī)溶液，也可以采用有機(jī)溶液，白英有機(jī)溶液提取物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的抑制作用有待臨床進(jìn)一步研究。本研究旨在探討白英生物堿（Solanumlyratum Thunberg alkaloid，STA）對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

江西省婦幼保健院藥劑科中藥房提供的白英（批號(hào)：20160911）;美國(guó)典型菌種收藏所（ATCC）提供的人宮頸癌HeLa細(xì)胞株（批號(hào)：29328），75%乙醇（濟(jì)南康奧醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：20171224）;二甲基亞砜（DMSO，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：302A0334）;胰蛋白酶消化液（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180420）;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，上海普飛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180527）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：20180711）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：20180605）。RE-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？婆d儀器有限公司），BIOBASE-EL10A型酶標(biāo)儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

①STA提?。涸?0℃環(huán)境中采用75%乙醇將50 g 白英粗粉浸泡3 h×3次，每次浸泡結(jié)束后均收集濾液，將3次的濾液合并在一起采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥并得到白英浸膏，DMSO溶解ST浸膏并配制10 g/L STA提取液，采用細(xì)胞培養(yǎng)液將上述STA提取液配制成4.0、8.0、16.0 mg/L等3種濃度備用，且分別定義為反應(yīng)體系A(chǔ)、B、C。②人宮頸癌HeLa細(xì)胞株培養(yǎng)：含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，直至細(xì)胞鋪滿瓶底，然后用0.25%胰蛋白酶消化液處理細(xì)胞，分瓶后3～5 d傳代1次。③細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞株，胰蛋白酶消化液處理后吹打成濃度為1.0×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，分別加入200 μl上述配好的4.0、8.0、16.0 mg/L STA，注意設(shè)置空白對(duì)照，每一濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)20 h后，在每孔中加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT液，37℃孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，在室溫下采用振蕩混勻10 min。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

通過(guò)MTT法檢測(cè)各反應(yīng)體系光密度（OD）值和對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制效果。①OD值：在細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)過(guò)程中，室溫振蕩混勻，待結(jié)晶充分溶解后在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，重復(fù)3次取平均值。②細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：采用如下公式進(jìn)行計(jì)算，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值）/空白對(duì)照組OD值×100%[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同反應(yīng)體系OD值的比較

不同濃度STA反應(yīng)體系的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系C的OD值顯著低于空白對(duì)照、反應(yīng)體系A(chǔ)及B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系B的OD值顯著低于空白對(duì)照和反應(yīng)體系A(chǔ)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系A(chǔ)的OD值顯著低于空白對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2不同反應(yīng)體系細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較

不同濃度STA反應(yīng)體系的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系C的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于反應(yīng)體系A(chǔ)和B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;反應(yīng)體系B的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著高于反應(yīng)體系A(chǔ)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

宮頸癌是目前臨床嚴(yán)重影響婦女健康的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，調(diào)查研究顯示，我國(guó)每年有大約20萬(wàn)婦女死于宮頸癌，其發(fā)生率僅次于乳腺癌，位居?jì)D女腫瘤疾患的第2位，且有年輕化的趨勢(shì)[8-9]。由于宮頸癌惡性程度高，對(duì)患者危害巨大，因此探索宮頸癌的防治方案成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要課題。在宮頸癌治療方面，西醫(yī)主推手術(shù)、放射治療、化療等方案，且這些方案的治療效果有目共睹，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)亦在宮頸癌患者的治療過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[10]。

眾所周知，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用的藥物眾多，其中白英藥用歷史久遠(yuǎn)，其具有清熱利濕、解毒消腫之功，既往在治療黃疸、水腫、膽結(jié)石、膽囊炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等諸多疾病方面取得了較好的治療效果[11]。隨著對(duì)白英研究的深入，白英抗腫瘤及治療相關(guān)并發(fā)癥的效果逐步得到認(rèn)可。韋星等[12]報(bào)道，將中藥白英湯實(shí)施于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，其臨床效果理想，安全性高?；粞娴萚13]報(bào)道，加味白英湯防治鼻咽癌三維適型放療后口腔干燥癥的臨床療效確切，可促進(jìn)患者唾液分泌量的增加，緩解口腔干燥癥狀。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面，白英抽提物對(duì)各種癌細(xì)胞株的拮抗作用亦得到研究。Yu等[14]報(bào)道，STA可明顯誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株凋亡，其機(jī)制可能與抑制NF-κB/p65信號(hào)通路有關(guān)。Endeshaw等[15]報(bào)道，STA能夠抑制Huh-7細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)控p38和Caspase-3蛋白有關(guān)。

既往臨床對(duì)白英治療宮頸癌細(xì)胞株的基礎(chǔ)研究亦有報(bào)道，白英水提物可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株產(chǎn)生抑制作用，包括上調(diào)野生型p53蛋白表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Fas基因表達(dá)以及下調(diào)FasL基因表達(dá)等。值得注意的是，既往探索白英治療宮頸癌的基礎(chǔ)研究主要采用白英水提物，白英乙醇提取物即STA研究報(bào)道較少，而諸多研究認(rèn)為白英水提物以及STA均有良好的抗腫瘤效果?；谠撉闆r，本研究亦設(shè)置3種不同濃度的STA反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，采用人宮頸癌HeLa細(xì)胞株作為觀察對(duì)象，結(jié)果顯示，隨著STA反應(yīng)體系濃度的增加，其OD值逐步下降，人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐步升高，提示STA對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。由于本研究的實(shí)驗(yàn)條件有限，STA對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]周先富.加味白英湯防治鼻咽癌三維適型放療后患者口腔干燥癥30例[J].浙江中醫(yī)雜志，2017，52（7）：496.

[2]李娟，劉月紅，顧萍，等.631例宮頸癌篩查結(jié)果分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2018，25（26）：79-81.

[3]趙令武，萬(wàn)福生.白英水提物誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（8）：883-887.

[4]韋星，李朝敢，農(nóng)嵩，等.白英提取液對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及P53和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，28（5）：714-717.

[5]韋星，李朝敢，農(nóng)嵩，等.白英提取液對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及Fas/FasL基因表達(dá)的影響[J].中藥材，2006，29（11）：1203-1206.

[6]歐陽(yáng)騫，陳慧娟，徐芳菲，等.辛伐他汀誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的效應(yīng)研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，35（6）：842-844.

[7]潘鋒.宮頸癌是可以全面預(yù)防的癌癥——訪中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院流行病學(xué)研究室主任喬友林教授[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2018，25（15）：1-3.

[8]李婷.疏肝清毒湯對(duì)肝郁型子宮頸癌化療患者臨床療效、中醫(yī)證候積分及凝血功能的影響[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2018，33（7）：1182-1186.

[9]霍焰，王淳，王梅，等.白英生物堿對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人神經(jīng)瘤母細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)醫(yī)藥，2018，13（11）：1738-1741.

[10]劉毓松，辛顯波.中藥白英湯配合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效觀察[J].中醫(yī)臨床研究，2018，10（20）：27-29.

[11]王劍，李玲香.加味白英湯防治鼻咽癌三維適型放療后口腔干燥癥的療效分析[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2017，19（5）：750-751.

[12]韋星，李朝敢，李韜，等.白英生物堿通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡[J].中藥材，2013，36（5）：787-790.

[13]霍焰，王梅，王曉波，等.白英生物堿對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞p38和Caspase-3表達(dá)的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2018， 11（7）：987-990.

[14]Yu Y，Shen HM，F(xiàn)ang DM，et al.LncRNA HCP5 promotes the development of cervical cancer by regulating MACC1 via suppression of microRNA-15a[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（15）：4812-4819.

[15]Endeshaw M，Clarke T，Senkomago V，et al.Cervical cancer screening among women by birthplace and percent of lifetime living in the united states[J].J Low Genit Tract Dis，2018，22（4）：280-287.

（收稿日期：2019-02-01? 本文編輯：劉克明）