李玉娟，陳如意，楊緬峰，陳偉

pSim6質(zhì)粒與新型反選擇系統(tǒng)聯(lián)用在重組工程的應(yīng)用

李玉娟，陳如意，楊緬峰，陳偉

廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

基因工程中，無痕修飾是一種很受歡迎的基因組操作技術(shù)。反選擇系統(tǒng)的嚴(yán)謹(jǐn)性決定了無痕修飾的效率。近期有文獻(xiàn)報(bào)道了一種新型的反選擇系統(tǒng)，該系統(tǒng)與質(zhì)粒pSim6聯(lián)用后反選擇嚴(yán)謹(jǐn)性較pKD46質(zhì)粒更高，預(yù)示著與pSim6質(zhì)粒聯(lián)用可以更高效地選擇出重組子。據(jù)此，對大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B中的4個(gè)不同的非必需基因位點(diǎn) (、、和) 進(jìn)行了分析，將不同長度的外源基因片段對預(yù)先插入這些位點(diǎn)的進(jìn)行基因替換。結(jié)果表明與pSim6質(zhì)粒聯(lián)用較其與pKD46質(zhì)粒聯(lián)用，重組效率均有顯著提高，并且隨著外源片段的增長，效果更明顯。外源片段為1 000 bp時(shí)，與pSim6質(zhì)粒聯(lián)用是其與pKD46聯(lián)用的1.2–2倍；外源片段為2 000 bp時(shí)，則是pKD46的2.2–5倍。綜上，與pSim6聯(lián)用具有更高的重組效率，更有利于大腸桿菌基因組的無痕修飾操作，這為大腸桿菌重組工程提供了更多的選擇。

Red重組系統(tǒng)，選擇反選擇系統(tǒng)，無痕修飾，大腸桿菌

同源重組是在基因工程中常用的技術(shù)手段，并且在基因打靶和基因克隆方面有著極其重要的作用。運(yùn)用同源重組技術(shù)，可以對巨大、復(fù)雜的染色體進(jìn)行修飾[1]。在代謝工程與功能基因組分析中，對大腸桿菌基因組修飾(點(diǎn)突變、插入、刪除、替換)的同源重組，一般用35–50 bp的同源臂，就可以發(fā)生有效的重組并且不需要限制性酶切位點(diǎn)。這種重組是由噬菌體重組酶 (λ-Red系統(tǒng)) 介導(dǎo)的，λ-Red系統(tǒng)是目前研究相對比較豐富的系統(tǒng)，它存在于λ-噬菌體左向操縱子上，其表達(dá)受pL啟動(dòng)子和CI857阻遏蛋白控制，由、和這3個(gè)基因組成，表達(dá)蛋白產(chǎn)物分別為Exo、Beta和Gam[2]。Exo蛋白具有核酸外切酶活性，能以5′–3′方向降解雙鏈DNA末端，從而留下3′單鏈突出端DNA分子[3-4]；Beta蛋白能結(jié)合由Exo消化產(chǎn)生的3′單鏈末端，防止DNA被單鏈核酸酶消化，同時(shí)促進(jìn)互補(bǔ)單鏈DNA區(qū)域間的退火，其在Red同源重組過程中起著決定性的作用[5]；Gam蛋白抑制核酸 RecBCD和 SbcCD 對線性雙鏈DNA分子的降解，協(xié)助Exo和Beta共同完成同源重組過程。運(yùn)用Red重組技術(shù)進(jìn)行染色體修飾主要有3種操作策略：DNA雙鏈介導(dǎo)的重組[6]、單鏈重組[7]和重疊引物介導(dǎo)的重組[8]。

在Red同源重組操作策略中，兩步選擇反選擇重組法[9]是報(bào)道最多且應(yīng)用最廣泛的策略，改造后不會產(chǎn)生多余的基因序列變化，可以達(dá)到“無痕修飾”的目的。其策略分為兩步：1) 通過電擊轉(zhuǎn)化將帶有同源臂的選擇反選擇片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在Red重組系統(tǒng)的表達(dá)下發(fā)生同源重組，通過正向選擇標(biāo)記 (一般為抗性基因如) 篩選陽性克?。?) 同樣用電轉(zhuǎn)化將帶有同源臂的外源片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，在Red重組系統(tǒng)的作用下進(jìn)行重組，完成基因敲除、替換或插入，通過反向選擇標(biāo)記基因 (如、、、和) 進(jìn)行篩選[10-15]。

一般來說，反向選擇比正向選擇效率低，并且都有很高的背景[16]或者特殊的要求，如宿主基因型需要在使用陰性選擇標(biāo)記基因之前修飾[17]，或者依靠最低限度的培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)更好的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性或需要特殊的選擇性條件。2019年，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并發(fā)表了一個(gè)新型的反選擇標(biāo)記基因[18]。λ噬菌體的基因由溫度敏感的cI857阻遏物操控下的pL啟動(dòng)子控制[19]，其表達(dá)可有效地導(dǎo)致宿主細(xì)胞存活力的喪失，因此將其作為反選擇標(biāo)記基因。研究中發(fā)現(xiàn)新構(gòu)建的反選擇基因比其他各種負(fù)選擇基因具有顯著的優(yōu)勢：高選擇嚴(yán)謹(jǐn)性、低背景、不需要特殊的試劑。我們在之前的研究中，在大腸桿菌MG1655的、、非必需位點(diǎn)分別測試了含有pSim6質(zhì)?；蚝衟KD46質(zhì)粒與反選擇系統(tǒng)聯(lián)用的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性。發(fā)現(xiàn)pKD46質(zhì)粒與聯(lián)用后選擇嚴(yán)謹(jǐn)性為7.6×10–7– 9.3×10–7，pSim6質(zhì)粒與聯(lián)用后選擇嚴(yán)謹(jǐn)性較低至2.3×10–6–5.1×10–6，較pKD46高了2–5倍。因此，我們推斷，pSim6質(zhì)粒與反選擇基因聯(lián)用后，雙鏈DNA片段的重組效率會比pKD46質(zhì)粒與反選擇基因聯(lián)用時(shí)有所提高。

因此本研究采用含有Red同源系統(tǒng)的pSim6質(zhì)粒，與新型的選擇反選擇系統(tǒng)聯(lián)合使用，在不同大腸桿菌菌株 (W3110、MG1655和DH10B) 中的4個(gè)不同位點(diǎn) (、、和) 進(jìn)行不同片段長度 (500 bp、1 000 bp和2 000 bp) 的替換，分析其重組效率，期望可以建立一個(gè)高選擇效率的重組工程系統(tǒng)，為更好地將重組工程無痕修飾提供了更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和質(zhì)粒：大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B為均為本室保存，GYpk1-tet (含有選擇反選擇系統(tǒng)) 為本室構(gòu)建，pSim6質(zhì)粒為美國國立衛(wèi)生研究院Court DL博士惠贈(zèng)。

工具酶和試劑：PrimerSTARGXL DNA 高保真酶購自日本TaKaRa生物公司，PCR酶購自民賽生物 (廣州) 科技有限公司；Tet (四環(huán)素)、Amp (氨芐霉素) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Axygen公司；PCR引物為生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增及鑒定引物：帶同源臂引物序列見表1，帶有下劃線的代表同源臂序列，不帶下劃線的代表PCR擴(kuò)增引物序列；鑒定引物序列見表2。

表1 本研究所用帶同源臂引物

The single underlined sequences indicate homology arms.

表2 本研究所用鑒定引物

1.2 方法

1.2.1 甘油/甘露醇梯度[20]感受態(tài)的制備與電擊轉(zhuǎn)化

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌W3110等3個(gè)菌株按1∶100 (500 μL) 稀釋到50 mLSOB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至600在0.4–0.6之間。然后冰浴30 min (含有pSim6質(zhì)粒的菌株在42 ℃誘導(dǎo)15 min后冰浴30 min)。將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌處理的50 mL聚丙烯離心管中，4 ℃、5 500 r/min、7 min離心收集菌體，棄上清，加1 mL預(yù)冷的ddH2O重懸，再加15 mL ddH2O混勻，加15 mL甘油/甘露醇溶液伸到管底，緩慢加入，形成分層，4 500 r/min、6 min、4 ℃離心；重復(fù)3次后加1 mL 甘油/甘露醇溶液重懸于1.5 mL的EP管，6 500 r/min、4 min、4 ℃離心；后棄上清，加甘油/甘露醇溶液使總體積約為200 μL。取50 μL感受態(tài)與300 ng的打靶分子DNA片段進(jìn)行電轉(zhuǎn) (條件為電壓1.8 kV，電容25 μF，電阻200 ?)，立即用2 mL SOC培養(yǎng)基復(fù)蘇2 h。

1.2.2 線性雙鏈DNA介導(dǎo)的DNA重組

同源臂的設(shè)計(jì)遵循GC含量分布均勻且含量約為50%的原則，長度在35–50 bp最佳，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增含同源臂的基因片段由同源臂長度為38 bp以及21 bp的擴(kuò)增引物組成。使用高保真酶擴(kuò)增，擴(kuò)增條件是：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 kb/min (31個(gè)循環(huán))；68 ℃ 10 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增的線性雙鏈DNA分子經(jīng)純化回收后與感受態(tài)混合，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。用含篩選標(biāo)記 (Amp/Tet) 的LB平板或者其他條件 (42 ℃) 的LB平板篩選發(fā)生基因重組后的陽性克隆。

1.2.3選擇反選擇方法

①通過抗性基因進(jìn)行正向選擇，PCR合成打靶分子 (兩側(cè)帶有同源臂的片段)，取約300 ng的回收產(chǎn)物與50 μL的感受態(tài)細(xì)菌混合，電擊轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇2 h，涂于含Amp (25 μg/mL) 和 Tet (10 μg/mL) 的LB平板上，30 ℃培養(yǎng)過夜后篩選陽性克隆。②利用基因在42 ℃下的致死效應(yīng)進(jìn)行第二步反選擇篩選，使用基因?yàn)槟０?，通過高保真酶擴(kuò)增兩側(cè)帶有同源臂的線性化DNA分子，擴(kuò)增不同長度的外源片段 (500 bp，1 000 bp和2 000 bp)。試劑盒純化后取300 ng的回收產(chǎn)物與①中鑒定正確的50 μL陽性克隆感受態(tài)混合，電擊轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)2 h，涂于無抗板 (200 μL菌液混合物) 在42 ℃過夜培養(yǎng)篩選。

1.2.4 重組克隆的鑒定

①選擇反選擇系統(tǒng)的鑒定：用各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增上游引物 (lacIF、ackF、dbpaF和glkF) 與片段中的下游引物 (TetA-R) 進(jìn)行PCR鑒定。②外源片段的鑒定：用外源基因片段中上游引物 (catjdF) 與各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增下游引物 (lacIR、ackR、dbpaR和glkR) 進(jìn)行PCR鑒定。用mix聚合酶鑒定，擴(kuò)增條件是：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/min (31個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。

1.2.5 重組效率的計(jì)算

從42 ℃無抗板各挑取23個(gè)單克隆與一個(gè)陰性克隆 (未轉(zhuǎn)外源片段的42 ℃平板) 進(jìn)行PCR鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)正確條帶的數(shù)目與總數(shù)的比值則為重組效率，重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ack位點(diǎn)的pSim6與kil聯(lián)用

基因 (GenBank登錄號: BAA16135.1) 是大腸桿菌基因組上的非必需基因，其表達(dá)乙酸激酶，它的缺失可使乙酸減少，增加谷氨酸的的產(chǎn)量[21]。因此我們在此位點(diǎn)用不同長度的外源片段進(jìn)行替換。圖1A為重組后鑒定圖，然后從菌落表型 (圖1B、1C) 上可以觀察到：pSim6與聯(lián)用后與pKD46與聯(lián)用后相比較，空轉(zhuǎn)菌落數(shù)量差不多，轉(zhuǎn)cat500的外源片段，pSim6菌落數(shù)量相對較多；轉(zhuǎn)cat1k的外源片段，pSim6菌落數(shù)量與pKD46差異較為明顯；轉(zhuǎn)cat2k的外源片段，pSim6菌落數(shù)量與pKD46差異更為明顯。因此我們對pSim6質(zhì)粒與聯(lián)用的重組克隆進(jìn)行PCR鑒定，每次挑選23個(gè)，重復(fù)3次，圖1D為瓊脂糖凝膠電泳分析。圖1E為從圖1D得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行重組效率分析圖，圖中可以觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達(dá)90%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在71%–88%之間，外源片段為2 000 bp時(shí)，同源重組的重組率約為50%–94%。pKD46與聯(lián)用后的重組效率[18]分別為82.61% (500 bp)、47.83% (1 000 bp) 和13.04% (2 000 bp)。結(jié)果表明pSim6與聯(lián)用后比pKD46與聯(lián)用后的重組效率有明顯的提高。

圖1 ack位點(diǎn)的重組效率分析

2.2 lacI位點(diǎn)的pSim6與kil聯(lián)用

通過在位點(diǎn)進(jìn)行不同片段同源重組后，pSim6質(zhì)粒與兩者聯(lián)用，與pKD46質(zhì)粒與聯(lián)用相比較，重組效率相對提高。對此，我們在其他非必需位點(diǎn)對pSim6質(zhì)粒和反選擇系統(tǒng)聯(lián)用進(jìn)行多基因位點(diǎn)驗(yàn)證，觀察是否有同樣的重組效率。挑選了另外3個(gè)大腸桿菌非必需位點(diǎn)[22](GenBank登錄號: BAE76127.1)、[23](GenBank登錄號: BAA14946.1)、[24](GenBank登錄號: BAA16258.1) 進(jìn)行分析。首先對基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，用引物lacIF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 931 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖2A)。從圖2B中可以看到500 bp片段很容易被替換，重組率為85%–100%。長度增加至1 000 bp，重組率在60%–80%，外源片段為 2 000 bp時(shí)，同源重組的重組率約為50%–60%。

2.3 dbpa位點(diǎn)的pSim6與kil聯(lián)用

接下來對位點(diǎn)進(jìn)行分析，用引物dbpaF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 833 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖3A)。同樣挑選23個(gè)單克隆與1個(gè)未轉(zhuǎn)外源片段單克隆作對照，用引物catjdF (外源片段上的基因序列) 與dbpaR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳并拍照觀察正確條帶。重復(fù)3次取平均值，結(jié)果如圖3C所示。從圖3B觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達(dá)97%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在82%–95%之間，外源片段為2 000 bp時(shí)，同源重組的重組率約為75%–82%。

圖2 lacI位點(diǎn)的重組效率分析

2.4 glk位點(diǎn)的pSim6與kil聯(lián)用

最后選擇了在非必需基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，用引物glkF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 969 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖4A)。同樣挑選23個(gè)單克隆與1個(gè)未轉(zhuǎn)外源片段單克隆作對照，用引物catjdF (外源片段上的基因序列) 與glkR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳并拍照觀察正確條帶。重復(fù)3次取平均值，結(jié)果如圖4B所示。從圖4C觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達(dá)85%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在63%–100%之間，外源片段為2 000 bp時(shí)，同源重組的重組率約為42%–84%。

圖3 dbpa位點(diǎn)的重組效率分析

圖4 glk位點(diǎn)的重組效率分析

3 討論

重組工程是一種應(yīng)用廣泛的體內(nèi)基因工程方法，它使DNA修飾變得簡單有效，并對其修飾時(shí)不需要限制性內(nèi)切酶。Datta等[25]構(gòu)建了一系列的重組質(zhì)粒，pSim6是里面選擇強(qiáng)度較高的質(zhì)粒。它是從pSim5質(zhì)粒衍生出來的，來源于嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒pSC101，16個(gè)低拷貝數(shù)，在質(zhì)粒中保留了Exo下游的天然tL3轉(zhuǎn)錄終止子，這可以防止Exo的過度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)入?yún)^(qū)域。質(zhì)粒中的Red重組系統(tǒng)在溫度敏感 (YS) 抑制因子CI857控制pL操縱子表達(dá)，在30–34 ℃下抑制因子有活性從而阻止pL操縱子表達(dá)，遏止Red重組酶的轉(zhuǎn)錄。溫度短暫升至42 ℃，阻遏物瞬時(shí)變性，啟動(dòng)Red系統(tǒng)的表達(dá)；再回到低溫時(shí)，阻遏基因重新復(fù)制，結(jié)合pL操縱子，重新阻遏Red系統(tǒng)。在多次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)42 ℃、15 min為高效表達(dá)Red重組酶的最佳條件[26]。相對比之前所用的pKD46質(zhì)粒[19]，不需要誘導(dǎo)物 (L-阿拉伯糖) 的誘導(dǎo)，且選擇強(qiáng)度高，簡捷方便。

為了在基因組工程中為反選基因提供一種替代方法，在本研究中我們使用了一種新型的反選擇標(biāo)記基因[27]?；蛟诘蜏貤l件下 (如30 ℃)，pL被cI857抑制，從而抑制基因表達(dá)。當(dāng)溫度升高至到42 ℃時(shí)，因?yàn)槭Щ畹腸I857阻遏蛋白不能阻遏pL啟動(dòng)子，啟動(dòng)了基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終造成了宿主菌的死亡。在之前的研究[19]中已經(jīng)對基因的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性在3個(gè)大腸桿菌菌株的3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其選擇嚴(yán)謹(jǐn)性相對較高 (幾乎等同于tet-sacB選擇反選擇系統(tǒng)[28])。因此我們將pSim6質(zhì)粒與基因聯(lián)合使用，在3個(gè)不同的大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B的4個(gè)非必需基因位點(diǎn)、、和進(jìn)行重組效率分析。兩者聯(lián)用后，與研究中重組效率相比較，從而得出以下結(jié)果：外源片段500 bp重組效率兩者聯(lián)用與之前均很高，在80%以上；當(dāng)外源片段增加至1 000 bp時(shí)，聯(lián)用后的重組效率約是之前基因的1.2–2倍；當(dāng)外源片段增加至2 000 bp時(shí)，聯(lián)用后的重組效率約是之前基因的2.2–5倍。

兩者聯(lián)用后重組效率增長的原因是未知的?？赡軄碜詐Sim6的多個(gè)cI拷貝在未誘導(dǎo)的情況下賦予對基因更高水平的調(diào)控，因此在42 ℃條件下蛋白可以高效表達(dá)進(jìn)而有效地殺死宿主菌株。這種效率上的差異可能歸因于基因的更高的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性。

隨著基因工程發(fā)展越來越快，基因編輯的方法日益增加。從而，本研究用含有高效的Red重組系統(tǒng)的pSim6質(zhì)粒通過與新穎的反選擇系統(tǒng)這一技術(shù)融合，降低了反選擇標(biāo)記的高背景，同時(shí)提高了對基因無痕修飾重組效率。雖然誘導(dǎo)性毒素系統(tǒng)[10]目前是反選擇系統(tǒng)中最好的一種，在一些條件下，的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性比不上誘導(dǎo)型毒素系統(tǒng)的選擇嚴(yán)謹(jǐn)性，但是在該技術(shù)中不需要延長的孵育、特殊的試劑以及選擇性條件，基因除了有殺菌作用之外，還有抑菌的作用。這種思路在某些情況下還是有一定的優(yōu)勢，向研究者提供了更多的方向和方法。為代謝工程和功能基因組的分析研究縮短了時(shí)間，提高了效率，使大腸桿菌的染色體改造更加便捷，從而推動(dòng)了微生物科學(xué)的前進(jìn)與發(fā)展。

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Combination of novel counter-selection systemand pSim6 plasmid in recombination engineering

Yujuan Li, Ruyi Chen, Mianfeng Yang, and Wei Chen

Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates, School of Biosciences and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, Guangdong,China

Seamless modification is a popular genomic manipulation technique in genetic engineering. Selection stringency of the counter-selection system determines the efficiency of the seamless modification. Recently, a novel counter-selection system,, was constructed. It is reported that the selection selectivity ofis higher in host bacteria harboring plasmid pSim6 than that harboring pKD46, indicating that recombinants could be selected out more efficiently by combiningcounter-selection system and plasmid pSim6. In order to confirm this speculation, four different loci (,,,) instrains W3110, MG1655 and DH10B were selected for testing: dsDNA fragments of different sizes (500 bp, 1 000 bp, and 2 000 bp) were used to substitute. As expected, recombination efficiency was higher in host bacteria harboring plasmid pSim6 than that harboring pKD46, and the results were more obvious with the length of dsDNA increasing. Specifically, recombination efficiency was 1.2 to 2 fold higher in pSim6 harboring bacteria than in pKD46 harboring bacteria when dsDNA fragments were 1 000 bp in length. With the length of dsDNA increasing up to 2 000 bp, the gap increased to 2.2–5 fold. In conclusion, it is easier to perform seamless modification by combiningcounter-selection system and plasmid pSim6 than combiningand pKD46. An alternative tool in genomic engineering is provided in this study.

Red recombination system, selection/counter-selection system, seamless modification,

February 27, 2019;

May 20, 2019

Science and Technology Program of Guangdong Province (No. 2015A010107014), National Natural Science Foundation of China (No. 31501895).

Wei Chen. Tel: +86-20-39352201; E-mail:thinker98@163.com.

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2015A01017014) 資助，國家自然科學(xué)基金 (No. 31501895)。

2019-06-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190628.1331.002.html

李玉娟, 陳如意, 楊緬峰, 等. pSim6質(zhì)粒與新型反選擇系統(tǒng)聯(lián)用在重組工程的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1761–1770.

Li YJ, Chen RY, Yang MF, et al. Combination of novel counter-selection systemand pSim6 plasmid in recombination engineering. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1761–1770.

(本文責(zé)編 陳宏宇)