何峰容，孫穎，樂鑫，劉勇，劉夢元,3

人IL-35單克隆抗體制備及其在定量ELISA檢測方法中的應(yīng)用

何峰容1,2，孫穎2，樂鑫2，劉勇2，劉夢元1,2,3

1 湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062 2 武漢云克隆科技股份有限公司，湖北 武漢 4 30056 3 藥物高通量篩選國家與地方聯(lián)合工程研究中心，湖北 武漢 430062

為了建立人白細(xì)胞介素-35 (IL-35) 的定量ELISA檢測方法，RT-PCR 克隆了人IL-35的IL-27EBI3亞基和IL-12p35亞基的編碼基因，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了2個亞基的高效表達(dá)。以大腸桿菌表達(dá)的IL-27EBI3和IL-12p35重組蛋白作為免疫原，免疫BaLb/c小鼠，選取陽性血清小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，用間接ELISA和有限稀釋法進(jìn)行單克隆雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆，獲得了穩(wěn)定分泌抗IL-27EBI3和抗IL-12p35單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。在效價測定和特異性鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗IL-27EBI3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3B11和一株能穩(wěn)定分泌抗IL-12p35 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3A10，亞類鑒定兩株單抗均為IgG1。應(yīng)用單抗3B11和3A10建立了IL-35雙抗夾心定量ELISA檢測方法，借助生物素-親和素放大效應(yīng)，該方法檢測IL-35線性范圍為3.12–200 pg/mL，最低檢測限為1.26 pg/mL，與多種其他抗原的交叉反應(yīng)率為0.1%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為5.1%–5.6%，批間RSD為5.6%–7.2%，添加回收率為89%–103%，達(dá)到定量分析的要求，為進(jìn)一步組裝IL-35定量ELISA檢測試劑盒打下了基礎(chǔ)。

人白細(xì)胞介素IL-35，單克隆抗體，定量ELISA，試劑盒

白細(xì)胞介素IL-35是最新發(fā)現(xiàn)的IL-12細(xì)胞因子家族的成員，是由IL-12家族α鏈p35 (IL-12p35)和一個β鏈EBI3組成的異源二聚體蛋白[1]。p35亞基在人體內(nèi)廣泛組成型表達(dá)，可與p40組成IL-12。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) 誘導(dǎo)基因3 (EBI3) 是IL-12的p40亞基同源物，最初在被EB病毒感染的B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，可與IL-12家族的p28組成IL-27，因而也稱為IL-27EBI3。IL-35由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Regulatory T cell，Treg) 分泌，在T細(xì)胞分化中扮演著重要的角色[2]，可刺激Treg的增殖，抑制效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖，抑制CD4+T細(xì)胞分化為Th17效應(yīng)細(xì)胞，是繼TGF-β、IL-10、IL-27之后發(fā)現(xiàn)的一個新型免疫抑制性細(xì)胞因子[3-4]。IL-35在腫瘤、自身免疫病和感染性疾病發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[5-9]。在腫瘤微環(huán)境中，IL-35可有效抑制T細(xì)胞對腫瘤的免疫應(yīng)答，IL-35還可通過趨化髓源性抑制細(xì)胞(MDSC) 在腫瘤內(nèi)聚集并促進(jìn)腫瘤的血管形成，從而促進(jìn)腫瘤的生長和免疫逃逸[2,10]。在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中，IL-35通過擴(kuò)增Tregs，抑制Th1和Th17效應(yīng)細(xì)胞的分化和免疫應(yīng)答，減少TNF-α和IL-17的分泌，有效減輕關(guān)節(jié)炎癥[11-12]。在感染性疾病中，IL-35則發(fā)揮著雙重作用，急性感染時，IL-35可明顯誘導(dǎo)Th1細(xì)胞清除感染，同時擴(kuò)增Tregs并抑制Th17細(xì)胞分化；慢性感染時，擴(kuò)增的Tregs則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，防止過度免疫損傷的發(fā)生[11]。越來越多的研究證實(shí)人血清IL-35的水平與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。腫瘤患者血清中的IL-35升高而自身免疫疾病患者血清IL-35降低，提示IL-35可能成為相關(guān)疾病的診斷和監(jiān)測標(biāo)志物。事實(shí)上，IL-35是多種惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物，也是多種惡性腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)[13-18]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)RA患者血清IL-35水平顯著低于健康人群，抗TNF-α治療可有效誘導(dǎo)RA患者Tregs的增殖，上調(diào)血清IL-35的水平，血清IL-35水平的變化可作為監(jiān)測RA病情和評價治療效果的參考指標(biāo)[19-20]。乙型肝炎病毒(HBV) 感染可顯著提升血清IL-35水平，有證據(jù)表明IL-35參與HBV導(dǎo)致的肝硬化形成，故IL-35水平可作為乙型肝炎疾病進(jìn)展和藥物療效的重要評價指標(biāo)[21-22]。這些資料表明，IL-35的定量檢測不僅對其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)研究具有重要意義，而且對腫瘤、自身免疫疾病及感染性疾病的診斷、藥物療效和預(yù)后的評價同樣具有重要的意義。

IL-35是一個新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，市面上針對IL-35的檢測工具很少，目前主要依賴進(jìn)口。我們制備了IL-35兩個亞基IL-12p35和IL-27EBI3的重組蛋白，通過單克隆抗體雜交瘤技術(shù)獲得了針對IL-12p35和IL-27EBI3的單克隆抗體，建立了IL-35雙抗夾心定量檢測方法，并對該檢測方法的各項性能進(jìn)行了綜合評價，為進(jìn)一步組裝成IL-35的定量檢測試劑盒打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒，菌株和細(xì)胞株

原核表達(dá)載體pTS為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建和保存。大腸桿菌Top10 (用于分子克隆和質(zhì)粒保存)，大腸桿菌BL21 star (DE3) (用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞) 均購自天根生化科技 (北京) 有限公司。SP2/0購自中國典型培養(yǎng)物保存中心，并由實(shí)驗(yàn)室傳代保存。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUEVC) 購自武漢原生原代生物科技有限公司。

1.2 試劑與動物

重組人IL-35、IL-12、IL-23、IL-27、IL-6、IL-10及TNF-α購自Peprotech公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA多聚酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒購自大連寶生物 (TaKaRa)。Ni-NTA親和層析凝膠、A蛋白親和層析凝膠購自Pharmacia公司。弗氏完全佐劑購自Sigma公司。單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Proteintech公司。水溶性生物素化試劑N-羥基磺酸基琥珀生物素 (Sulfo-NHS-Biotin) 及親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP) 購自Thermo Fisher Scientific。雌性Balb/c小鼠購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的操作嚴(yán)格按照國家科技部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動物管理條例》進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和RNA的提取

用含10%小牛血清的ECM培養(yǎng)基 (Sciencell) 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUEVC)，待細(xì)胞90%匯合時，加入1 ng/mL的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，胰酶消化，收集細(xì)胞。用RNA提取試劑盒提取HUEVC細(xì)胞總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 IL-27EBI3和IL-12p35基因的克隆

根據(jù)GenBank中IL-27EBI3已知序列(GenBank Accession No. NM_005755.2) 和IL-12p35已知序列 (GenBank Accession No. NM_000882.3) 設(shè)計擴(kuò)增IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因的引物，引物如表1所示。在PCR反應(yīng)管中加入HUEVC細(xì)胞總RNA 5 μL，70 ℃作用5 min后冷卻至0 ℃，依次加入超純水9.5 μL，5×AMV緩沖液5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 2.5 μL，RNasin 1 μL和AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，于50 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。在PCR反應(yīng)管中加入超純水34 μL，10×PCR緩沖液5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，25 mmol/L MgCl225 μL，DNA聚合酶1 μL，其中P1、P2擴(kuò)增IL-27EBI3編碼基因，P3、P4擴(kuò)增IL-12p35編碼基因。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；然后95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃保存。對擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pTS分別進(jìn)行Ⅰ和HⅠ雙酶切，將IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因分別連入載體pTS中，形成IL-27EBI3表達(dá)載體pTES和IL-12p35的表達(dá)載體pTPS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，進(jìn)行載體的擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，確?；虻倪B接和序列正確，表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 star (DE3)，形成穩(wěn)定表達(dá)IL-27EBI3和IL-12p35的基因工程重組菌株。

表1 擴(kuò)增IL-27EBI3和IL-12p35編碼序列的引物

Note: P1 and P2 are for the amplification of gene encoding IL-27EBI3, and P3 and P4 for the amplification of IL-12p35.I andH I restriction sites (Underlined) were introduced to the primers for cloning purpose. The protective bases are marked with bold.

1.5 IL-27EBI3和IL-12p35的表達(dá)與復(fù)性

將含有表達(dá)載體IL-27EBI3/pTES和含有表達(dá)載體IL-12p35/pTPS的大腸桿菌BL21 star (DE3)接種25 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖動過夜，以1∶40轉(zhuǎn)接于1 L含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，置于5 L搖瓶中于37 ℃搖動培養(yǎng)至600為0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，誘導(dǎo)IL-27EBI3和IL-12p35的表達(dá)。培養(yǎng)物于4 ℃、12 000×離心20 min，收獲菌體，重懸于超聲緩沖液中，超聲破碎菌體，12% SDS-PAGE檢測，觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。目標(biāo)蛋白包涵體的變性及其在變性條件下的固定化Ni2+親和層析純化按常規(guī)方法進(jìn)行，并經(jīng)12% SDS-PAGE檢測。將純化的包涵體蛋白稀釋到250 μg/mL，裝入適當(dāng)大小的透析袋，進(jìn)行逐步移除變性劑尿素的透析復(fù)性。即對100倍體積分別含4、2、1及0 mmol/L尿素的硼酸緩沖液 (0.9% () 硼酸，0.3% () NaOH，pH 9.6) 從高到低分步透析，每個尿素濃度透析4 h，并 在含2、1、0 mmol/L尿素的硼酸緩沖液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH/GSSG (1 mmol/L/ 1 mmol/L) 作為復(fù)性添加劑。最后，蛋白置于100倍體積20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中透析2次，每次4 h，徹底去除殘留的尿素和其他雜質(zhì)，并 通過0.22 μm的濾膜過濾除菌，超濾濃縮，凍干備用。

1.6 動物免疫

以純化的重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35作為免疫原，背部皮下分別注射5只6周齡雌性Balb/c小鼠，免疫前取血作為陰性血清對照。初次免疫劑量為100 μg/只，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周以相同劑量免疫原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后免疫。第4次加強(qiáng)免疫2周后，從小鼠尾靜脈少量取血，經(jīng)間接ELISA檢測血清抗體效價，選效價較高的小鼠于細(xì)胞融合前3天經(jīng)腹腔注射免疫原100 μg加強(qiáng)免疫。斷頸處死小鼠，按文獻(xiàn)方法分離小鼠脾細(xì)胞[23]。

1.7 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選

將增殖期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和新鮮分離的免疫小鼠的脾細(xì)胞按5∶1的比例混勻，離心棄上清后加入50%的聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合，然后緩慢加入RPMI-1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心棄上清，用HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 7 d后改用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。用重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35作為抗原，以不含外源基因的空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照，采用間接ELISA對細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，將陽性反應(yīng)孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，直至篩選出由單個細(xì)胞繁殖而來且ELISA反應(yīng)陽性的細(xì)胞克隆。

1.8 間接ELISA

用間接ELISA方法進(jìn)行血清抗體效價和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價的檢測。具體方法如下：以重組IL-27EBI3和IL-12p35作為檢測抗原，以空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解蛋白作為陰性對照抗原，包被96孔ELISA板，1 μg/mL， 100 μL/孔，4 ℃過夜，PBST洗板3次，5%的脫脂奶粉100 μL/孔封閉2 h，PBST洗板3次，于每孔加入倍比稀釋血清或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每稀釋度3個復(fù)孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL羊抗鼠IgG (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL顯色液 (1 mmol/L OPD，0.016% H2O2)，37 ℃避光孵育10 min，加入硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取每孔490 nm處吸收值 (490)。

1.9 單克隆抗體的鑒定

單克隆抗體亞型的鑒定按照試劑盒說明書進(jìn)行。單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性采用Western blotting檢測，具體方法如下：將5 μg不同抗原分別點(diǎn)樣于0.45 μm硝酸纖維濾膜 (美國Pall Gelman)，于25 ℃靜置晾干，以重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35為陽性對照，以不含外源基因的空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照；將膜浸泡于5%的脫脂牛奶中4 ℃封閉過夜，1×PBS (pH 7.4) 洗膜3次；將膜浸泡于含1 μg/mL單克隆抗體的1×PBS (pH 7.4) 中，37 ℃孵育2 h，1×PBS洗膜3次；將膜浸泡于含HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG (1∶1 000稀釋) 的1×PBS (pH 7.4)中，37 ℃孵育1 h，1×PBS洗膜3次；加入DAB顯色劑，待顯色到理想程度，自來水沖洗終止反應(yīng)。

1.10 單克隆抗體的收集與純化

對篩選出的穩(wěn)定分泌目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除沉渣，按常規(guī)方法用Protein A柱對單抗進(jìn)行純化，純化后的抗體對20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)透析換液，超濾濃縮備用。

1.11 生物素標(biāo)記抗體的制備

將待標(biāo)記的抗體用0.1 mol/L的碳酸鹽緩沖液 (pH 8.0) 稀釋到1 mg/mL，于2 mL蛋白質(zhì)溶液中加入Suf-NHS-Biotin，使其終濃度為120 μg/mL，于25 ℃持續(xù)攪拌24 h，向反應(yīng)體系中加入9.6 μL 1 mmol/L NH4Cl，于25 ℃持續(xù)攪拌10 min，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入透析袋中，于4 ℃對1×PBS (pH 7.4) 透析4 h以除去游離的生物素，將樣品上Sephadex G-25凝膠層析柱，1×PBS洗脫，收集蛋白質(zhì)峰，超濾濃縮備用。

1.12 雙抗夾心ELISA檢測IL-35方法的建立

建立雙抗夾心ELISA方法，即以抗IL-27EBI3的單克隆抗體作為包被抗體，捕獲樣品中的IL-35，以生物素化的抗IL-12p35單克隆抗體作為檢測抗體，加入親和素化的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP) 進(jìn)行偶聯(lián)和信號放大，最后加入底物TMB顯色，測定450 nm處的吸光值(450)。首先，基于棋盤法確定最優(yōu)的抗體包被濃度和生物素化抗體的工作濃度。制備抗IL-27EBI3的單克隆抗體包被量不同的3種酶聯(lián)板：1 μg/孔 (10 μg/mL，100 μL)、500 ng/孔 (5 μg/mL，100 μL)、100 ng/孔 (1 μg/mL，100 μL)。每種包被量的酶聯(lián)板中加入100 μL系列濃度的IL-35 (200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.12 pg/mL)。每個濃度的IL-35檢測孔分別采用3種不同濃度的生物素化抗IL-12p35單克隆抗體 (500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL)，100 μL/孔。按常規(guī)方法進(jìn)行夾心ELISA的操作，以450值≥0.2為陽性cutoff值，觀察上述不同組合方式檢測IL-35的靈敏度，確定包被抗體的最佳使用量和生物素抗體的最佳工作濃度。

1.13 定量曲線的構(gòu)建

以確定的最佳用量包被抗IL-27EBI3的單克隆抗體于96孔ELISA板，每孔于100 μL 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中，4 ℃過夜。PBST洗板3次，5%的脫脂奶粉100 μL/孔，37 ℃封閉2 h，PBST洗板 3次，加入100 μL /孔系列濃度的IL-35 (400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.12 pg/mL、1.56 pg/mL、0 pg/mL)，37 ℃孵育2 h。PBST洗板3次，加入100 μL/孔最佳工作濃度的生物素化抗IL-12p35單克隆抗體，37 ℃孵育2 h。PBST洗板3次，加入100 μL/孔親和素化的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP)，37 ℃孵育1 h。PBST洗板 3次，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃避光孵育10 min。加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450 nm吸收值 (450)，每個IL-35濃度3復(fù)孔，取平均450。以450為縱坐標(biāo)，IL-35濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用GraphPad Prism進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，確定檢測的線性范圍和定量方程。

1.14 靈敏度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度評價

將各種待檢細(xì)胞因子用樣品稀釋液 (1×PBS) 稀釋為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白定量采用Bradford法。然后根據(jù)下述實(shí)驗(yàn)要求分別稀釋成相應(yīng)的質(zhì)控品。用上述建立的夾心ELISA方法測定20個空白樣品即樣品稀釋液 (1×PBS) 的450值，將測定的平均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值代入定量方程，所得到的樣品濃度值即為該檢測方法的最低檢測下限 (靈敏度)。于7份樣品稀釋液 (1×PBS) 中分別添加重組IL-12p35、重組IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27、IL-6、IL-10，終濃度為20 pg/mL，每種待檢細(xì)胞因子3復(fù)孔，用上述建立的夾心ELISA方法分別測定上述細(xì)胞因子濃度，取平均值，特異性用交叉反應(yīng)率來表示，即實(shí)際測定濃度與實(shí)際添加濃度的比值(%)。用該方法測定IL-35的高 (200 pg/mL)、中 (50 pg/mL)、低 (5 pg/mL) 3個濃度的質(zhì)控品，每個質(zhì)控品測定15次，分3批測定，每批測定5次，計算檢 測數(shù)據(jù)的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative stardard deviation，RSD(%)) 和批間RSD(%)，評價檢 測方法的精密度 (重復(fù)性)。在含3.6 pg/mL IL-35的稀釋樣品中分別添加高、中、低濃度的IL-35，使其終濃度分別為13.6 pg/mL、43.6 pg/mL和 123.6 pg/mL，用該方法對樣品中的IL-35進(jìn)行測定，每個濃度3個復(fù)孔，準(zhǔn)確度用添加回收率表示，即實(shí)測濃度平均值減去原稀釋品濃度的差與實(shí)際添加濃度的比值(%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-27EBI3和IL-12p35的基因克隆、表達(dá)與制備

如圖1所示，RT-PCR從TNF-α刺激的人臍靜脈內(nèi)細(xì)胞 (HUVEC) 擴(kuò)增出IL-12p35和IL-27EBI3的編碼基因，大小分別為816 bp和759 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ⅰ和HⅠ雙酶切克隆至原核表達(dá)載體pTS，獲得IL-27EBI3表達(dá)載體pTES和IL-12p35的表達(dá)載體pTPS (圖2A)。IL-27EBI3和IL-12p35的編碼基因在強(qiáng)啟動子T7的控制之下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于大腸桿菌的超聲沉淀中，分子質(zhì)量大約為25 kDa和29 kDa，與理論大小一致 (圖2B、2C)。在變性條件下，重組蛋白通過固定化的Ni2+親和層析一步純化可達(dá)到95%以上的純度 (圖2B、2C)。通過緩慢去除變性劑尿素的透析復(fù)性以及超濾濃縮，可以從1 L大腸桿菌培養(yǎng)物中獲得25–30 mg的目的蛋白，濃度可達(dá)1 mg/mL。

2.2 抗IL-27EBI3和抗IL-12p35單克隆抗體的制備和鑒定

用純化制備的重組IL-27EBI3和IL-12p35分別免疫5只雌性Balb/C小鼠，選擇其中3只血清抗體效價較高的小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞。以重組IL-27EBI3和IL-12p35分別作為抗原，同時以空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照，用間接ELISA 對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，經(jīng)多輪檢測和有限稀釋法克隆3次后，獲得了3個穩(wěn)定分泌抗IL-27EBI3單克隆抗體的細(xì)胞株3B11、3D07、3E10和3個穩(wěn)定分泌抗IL-12p35單克隆抗體的細(xì)胞株3A10、3B09、3B12。在后續(xù)研究中，各單克隆抗體以其來源的細(xì)胞株命名。以重組IL-27EBI3和IL-12p35作為陽性對照，以空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 (BL21 star(DE3)) 裂解液作為陰性對照，Western blotting對上述細(xì)胞株分泌抗體的抗原特異性進(jìn)行了鑒定 (表2)。結(jié)果表明，單抗3B11、3D07、3E10都能與重組IL-27EBI3發(fā)生免疫反應(yīng)，3B11和3D07同樣能與含有EBI3亞基的IL-27和IL-35發(fā)生免疫反應(yīng)，與不含EBI3亞基的IL-12和IL-23不發(fā)生免疫反應(yīng)，同時也不具備與IL-6和IL-10的免疫反應(yīng)性，而3E10與IL-12和IL-23都具有交叉反應(yīng)。單抗3A10、3B09、3B12都能與重組IL-12p35發(fā)生免疫反應(yīng)，3A10和3B12同樣能與含有p35亞基的IL-12和IL-35發(fā)生免疫反應(yīng)，與不含p35亞基的IL-12家族成員IL-23和IL-27不發(fā)生免疫反應(yīng)，同時也不具備與IL-6和IL-10的免疫反應(yīng)性，而3B09與IL-23具有交叉反應(yīng)。對抗原特異性較好的3B11、3D07、3A10和3B12細(xì)胞株分泌抗體的效價進(jìn)行了測定 (圖3A)，發(fā)現(xiàn)單抗3B11效價高于3D07，3A10效價高于3B12，因而選取單抗3B11和3A10進(jìn)行后續(xù)研究。用Protein A柱對單抗3B11和3A10進(jìn)行純化制備，通過一步親和層析純化，純度可達(dá)到95%以上 (圖3B)。對純化樣品進(jìn)行超濾濃縮，蛋白濃度可達(dá)到2 mg/mL。依照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒的說明，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 和IgA的單抗為二抗，用夾心ELISA對單抗3A10和3B11進(jìn)行了亞類鑒定，發(fā)現(xiàn)兩株單抗均為IgG1 (圖4)。

圖1 IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因的RT-PCR克隆

圖2 IL-27EBI3和IL-12p35的表達(dá)與純化

表2 單克隆抗體的抗原特異性鑒定

Note: “+” means there is immunoreactivity between the mAb and antigens. “?” means there is no immunoreactivity between the mAb and antigens. Recombinant IL-27EBI3 and IL-12p35 were used as positive control and the cell lysates of BL21(DE3) transformed with the blank vector was used as negative control.

圖3 單克隆抗體的效價及純化

圖4 單抗3A10和3B11的亞類鑒定

2.3 雙抗夾心檢測IL-35方法的建立

以抗IL-27EBI3的單抗3B11作為包被抗體，捕獲樣品中的IL-35，以生物素化的抗IL-12p35單抗3A10作為檢測抗體，用Streptavidin-HRP及其底物TMB作為顯色手段，建立雙抗夾心檢測IL-35的方法。首先，我們確定了該檢測方法中包被抗體3B11和生物素化抗體3A10的最佳用量，如圖5A所示，用3種不同包被濃度的單抗3B11和3種不同濃度的生物素化單抗3A10進(jìn)行組合，對系列濃度的IL-35進(jìn)行了夾心ELISA檢測。以IL-35濃度為橫坐標(biāo)，450為縱坐標(biāo)，曲線明顯分為3個群，剛好代表了生物素化單抗3A10的工作濃度，工作濃度越高，450越大，其對450值的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單抗3B11的包被濃度。以450值≥0.2為陽性cutoff值，圖中曲線與直線450為0.2交點(diǎn)所對應(yīng)的軸的數(shù)據(jù)即為相應(yīng)條件下IL-35的最低檢測濃度，可見生物素化單抗3A10的工作濃度為500 ng/mL時IL-35的檢測靈敏度最高。而在同一生物素化單抗3A10用量的條件下，單抗3B11的包被濃度10 μg/mL、5 μg/mL及1 μg/mL檢測的敏感性差異不大，說明單抗3B11包被濃度為1 μg/mL已足夠。以確定的最佳抗體使用濃度建立標(biāo)準(zhǔn)的夾心ELISA，并對序列濃度的重組IL-35進(jìn)行檢測。當(dāng)IL-35濃度在200 pg/mL濃度以下時，檢測呈現(xiàn)出較好的線性，在400 pg/mL和800 pg/mL時測定值偏離線性，比理論線性值偏小，可能與IL-35在200 pg/mL時的結(jié)合達(dá)到飽和有關(guān)。選擇200 pg/mL及其以下濃度與對應(yīng)的450值作圖并進(jìn)行線性回歸，得到了回歸曲線和線性方程(圖5B)，該檢測方法的線性范圍在1.56–200 pg/mL。

圖5 IL-35 ELISA檢測方法的建立

2.4 雙抗夾心檢測IL-35方法的靈敏度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度

按照靈敏度的測定方法，我們測定了20個空白樣品即樣品稀釋液的450值，測定的平均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值為0.174，代入回歸方程，計算出最低檢測下限為1.26 pg/mL。同時，以重組1L-12p35、重組IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27以及2個非IL-12家族細(xì)胞因子IL-6、IL-10作為待檢物對該檢測方法的特異性進(jìn)行了評定，結(jié)果表明該檢測方法與IL-12家族成員1L-12p35、IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27的交叉反應(yīng)率均為0.1%，與IL-6和IL-10的交叉反應(yīng)率為0.1%。最后，我們對該檢測方法的精密度(重復(fù)性) 和準(zhǔn)確度進(jìn)行了評定，用該方法對高 (200 pg/mL)、中 (50 pg/mL)、低 (5 pg/mL)) 濃度的IL-35進(jìn)行分批多次檢測，計算了測定的批內(nèi)差和批間差，結(jié)果見表3，批內(nèi)RSD為5.1%–5.6%，批間RSD為5.6%–7.2%，完全可以滿足生物樣品中IL-35的快速定量檢測。用添加回收率作為準(zhǔn)確性的評定指標(biāo)，對終濃度為高(123.6 pg/mL)、中 (43.6 pg/mL)、低(13.6 pg/mL) 的IL-35添加品進(jìn)行檢測，計算出該檢測方法的添加回收率(表4) 分別為103%、90%及92%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測方法的各項指標(biāo)都達(dá)到了定量分析的要求。

3 討論

IL-35是IL-12家族的一個新型細(xì)胞因子，由Collison等于2007年最先發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)[1]。IL-12家族一共有4個成員，即IL-12、IL-23、IL-27和IL-35。這4個細(xì)胞因子均為異質(zhì)二聚體，均由一個螺旋束樣細(xì)胞因子亞單位(p35、p19、p28) 和一個可溶性細(xì)胞因子受體樣亞單位(p40和EBI3) 組成。

表3 IL-35定量ELISA檢測方法的精密度

表4 IL-35定量ELISA檢測方法的添加回收率(準(zhǔn)確度)

35、p19、p28具有同源性，EBI3和p40具有同源性，其中p35和 p40組成IL-12，p19 和p40組成IL-23，p28和EBI3組成IL-27，p35和EBI3組成IL-35[3]。IL-12家族成員的這種結(jié)構(gòu)特征和同源性決定了它們在免疫檢測上的復(fù)雜性，如果用完整的細(xì)胞因子進(jìn)行免疫制備單克隆抗體，很有可能篩選到抗同一亞單位的兩株抗體，而這一亞單位可能會在兩種細(xì)胞因子同時存在(如p40、EBI3)，因而應(yīng)用這兩株單抗進(jìn)行夾心ELISA檢測時會出現(xiàn)兩種細(xì)胞因子的交叉反應(yīng)。為了降低出現(xiàn)交叉反應(yīng)的可能性，我們采用了細(xì)胞因子亞單位分別進(jìn)行免疫的策略，用基因工程方法，制備了IL-35兩個亞單位IL-27EBI3和IL-12p35的重組蛋白，以重組蛋白作為免疫原，制備各自的單克隆抗體，再用抗EBI3和抗p35的單抗進(jìn)行夾心ELISA檢測IL-35，這就在很大程度上避免了IL-12家族中其他成員的交叉反應(yīng)。但是，我們還要考慮到p35、p19、p28之間的同源性和p40、EBI3之間的同源性，如EBI3與p40具有27%的氨基酸同源性，而且空間結(jié)構(gòu)極為相似，兩者具有相似的空間抗原表位，EBI3刺激產(chǎn)生的抗體有可能與p40發(fā)生交叉反應(yīng)。因而在本研究中，對用重組EBI3和p35作為抗原篩選出的單克隆抗體株還需作進(jìn)一步的特異性鑒定，以確定其是否與IL-12家族的其他成員之間具有交叉反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)抗EBI3的單抗3E10與IL-12和IL-23都具有交叉反應(yīng)，抗p35的單抗3B09與IL-23具有交叉反應(yīng)，這種交叉反應(yīng)的單抗在篩選的3株抗p35和3株抗EBI3單抗中各有1株，所占比率不小，但是否確實(shí)是與p40亞基或p19亞基發(fā)生交叉反應(yīng)還有待進(jìn)一步證實(shí)。利用鑒定出的特異性較好的單抗3A10和3B11建立的夾心ELISA與IL-12家族的另外3個成員IL-12、IL-23、IL-27的交叉反應(yīng)率均為0.1%，在檢測上能有效地排除同家族中其他3個細(xì)胞因子成員的干擾，說明用IL-12家族的其他細(xì)胞因子成員對制備單抗的特異性作進(jìn)一步鑒定顯得尤為重要，是篩選出特異性檢測抗體的關(guān)鍵。本研究制備IL-12家族細(xì)胞因子的特異性檢測抗體的思路和方法可為其他家族細(xì)胞因子檢測抗體的制備提供一定的借鑒和參考。

IL-35結(jié)構(gòu)上與其他IL-12家族成員相似，但其表達(dá)和分泌方式卻不同，小鼠IL-35組成型表達(dá)于CD4+CD25+Foxp3+Treg，而人類CD4+CD25+Foxp3+Treg卻不能組成型表達(dá)IL-35，其表達(dá)需要炎癥信號的刺激[4,24]。不僅如此，人類胸腺、淋巴結(jié)、扁桃體及外周血來源的T細(xì)胞亞群，包括效應(yīng)性T細(xì)胞，幼稚或記憶CD4+T細(xì)胞及γδT細(xì)胞均不組成型表達(dá)IL-35[25]。IL-35的這種表達(dá)方式給其兩個亞基p35和EBI3的基因克隆帶來了困難。最近Li等[25]的研究表明，IL-35除了表達(dá)于炎癥信號刺激的T細(xì)胞系外，還可表達(dá)于炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ) 刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈平滑肌細(xì)胞及單核細(xì)胞等非T細(xì)胞系。本研究中，在體外培養(yǎng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUEVC)，用TNF-α進(jìn)行刺激，利用RT-PCR成功克隆了IL-35兩個亞基p35和EBI3的編碼基因，為后續(xù)p35和EBI3的重組蛋白和單抗的制備提供了有力保障。HUEVCs可通過胰酶灌注新生兒臍帶制備單細(xì)胞懸液而獲得，來源較為豐富，容易獲得。其次，HUEVCs在體外容易進(jìn)行原代培養(yǎng)，用ECM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)就可以獲得大量細(xì)胞。盡管目前還沒有在炎性刺激的HUEVCs細(xì)胞中克隆IL-35編碼基因的報道，但HUEVCs的獲得和培養(yǎng)比CD4+CD25+Foxp3+Treg的獲得和培養(yǎng)更為容易。我們認(rèn)為，炎癥因子刺激的HUEVCs可作為IL-35編碼基因來源的一個重要模式細(xì)胞。

目前，國內(nèi)還沒有自主研發(fā)的IL-35檢測試劑盒，主要依賴于進(jìn)口。鑒于IL-35生物學(xué)功能以及其與多種疾病的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步的深入研究，研發(fā)其檢測試劑盒顯得尤為重要。我們用單抗雜交瘤技術(shù)制備了IL-35的單克隆抗體，建立了雙抗夾心的ELISA檢測方法，該方法的靈密度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度都達(dá)到了定量分析的要求，為組裝成IL-35 ELISA檢測試劑盒打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。我們將進(jìn)一步尋求維持該檢測方法中涉及到的各種試劑和蛋白的穩(wěn)定性及有效保存方法，并在臨床和科研標(biāo)本中進(jìn)行大批量的預(yù)試和性能評定，力爭組裝成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的IL-35檢測試劑盒。該方法不僅操作簡便，檢測成本低，而且可較短時間內(nèi)完成IL-35的定量分析，值得在高校、科研院所和醫(yī)療單位推薦使用。

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Preparation of monoclonal antibodies against human interleukin-35 and their application in a quantitative ELISA for interleukin-35 detection

Fengrong He1,2, Ying Sun2, Xin Yue2, Yong Liu2, and Mengyuan Liu1,2,3

1 State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China 2 Wuhan Coud-clone Science and Technology Co. Ltd, Wuhan 430056, Hubei, China 3 National and Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, Wuhan 430062, Hubei, China

To establish a quantitative ELISA for human interleukin-35 (IL-35) detection, we cloned cDNAs encoding the 2 subunits IL-27EBI3 and IL-12p35 of IL-35 by RT-PCR and transformed the cDNAs intoBL21 star (DE3) by recombinant DNA technology. IL-27EBI3 and IL-12p35 were expressed as recombinant proteins and used as immunogen to immunize Balb/c mice. Spleen cells from the positive serum mice were isolated and fused with SP-2/0 myeloma cells. We obtained the hybridoma cell lines stably secreting target antibodies by indirect ELISA screening of the cell supernatants with recombinant IL-27EBI3 and IL-12p35 as antigen and consecutive subcloning of the cells in the well with positive supernatant. Following further measurement of supernatant titers of the antibodies and identification of their antigen specificity, we obtained a hybridoma cell line 3B11 that stably secrets antibody against IL-27EBI3 and a hybridoma cell line 3A10 that secrets antibody against IL-12p35. Both monoclonal antibodies (mAbs) were identified as the subtype of IgG1. Finally, using the anti-IL-27EBI3 mAb from 3B11 as the capture antibody and the anti-IL-12p35 mAb from 3A10 as the secondary antibody, we established a quantitative double-antibodies sandwich ELISA for IL-35 detection with-Results demonstrated that the quantitative assay had a detection range of 3.12–200 pg/mL, a detectability of 1.26 pg/mL, and a crossing-reactive rate of 0.1%. The intra-batch RSD and the inter-batch RSD of the quantitative assay were 5.1%–5.6% and 5.6%–7.2%, respectively, and the fortified recovery was 89%–103%. Therefore, the sandwich ELISA assay for IL-35 meets the qualification of quantitative analysis and laid a stable foundation for the development of quantitative ELISA kit for IL-35 detection.

human interlukin-35, monoclonal antibody, quantitative ELISA, kit

April 8, 2019;

July 9, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 30973669/H3004), Key Science-Technology Foundation of Hubei Provincial Department of Education (No. D20141002).

Mengyuan Liu. Tel: +86-27-88661237; Fax: +86-27-88666106; E-mail: liumengy@tom.com

10.13345/j.cjb.190129

國家自然科學(xué)基金(No. 30973669/H3004)，湖北省教育廳重點(diǎn)研究計劃項目 (No. D20141002) 資助。

2019-07-22

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190722.0917.001.html

何峰容, 孫穎, 樂鑫, 等. 人IL-35單克隆抗體制備及其在定量ELISA檢測方法中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(9): 1723–1735.

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(本文責(zé)編 陳宏宇)