潘夢(mèng)妍，徐顯皓，劉延峰，李江華，呂雪芹，堵國成，劉龍

甲殼素酶Chisb的定向進(jìn)化及生物轉(zhuǎn)化合成幾丁寡糖

潘夢(mèng)妍1,2，徐顯皓1,2，劉延峰1,2，李江華1,2，呂雪芹1,2，堵國成1,2，劉龍1,2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

甲殼素酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，如可將蝦殼、蟹殼和其他甲殼廢物降解成以幾丁寡糖為主的高附加值產(chǎn)品，但野生型甲殼素酶催化效率低，大大限制了幾丁寡糖的生產(chǎn)。筆者在前期研究中表達(dá)了一個(gè)具有較高效催化效率的甲殼素酶Chisb，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。為進(jìn)一步提高甲殼素酶Chisb的催化效率，以R13NprB-C-SP-H為親本，采用易錯(cuò)PCR(Error-prone PCR)技術(shù)構(gòu)建隨機(jī)突變體文庫，對(duì)甲殼素酶Chisb進(jìn)行定向進(jìn)化。經(jīng)過96孔板初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得了兩個(gè)催化效率進(jìn)一步提高的突變體C43D和E336R。對(duì)突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，C43D和E336R的最適催化溫度為55 ℃，C43D的最適pH為5.0，E336R的最適pH為9.0；其催化效率相比對(duì)照分別提高了1.35倍和1.57倍；而E336R和C43D催化產(chǎn)幾丁寡糖的含量分別為2.53 g/L和2.06 g/L，相比對(duì)照(0.89 g/L)分別提高了2.84倍和2.31倍；底物轉(zhuǎn)化率分別為84.3%和68.7%，相比對(duì)照(29.7%)分別提高了54.6%和39%。研究表明，通過易錯(cuò)PCR引入隨機(jī)突變的方法能夠有效提高甲殼素酶Chisb的催化效率。上述研究獲得的催化效率提高的正向突變體及其酶學(xué)性質(zhì)分析對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成幾丁寡糖具有重要研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

甲殼素酶Chisb，幾丁寡糖，催化效率，易錯(cuò)PCR，定向進(jìn)化

甲殼素酶 (EC 3.2.1.14) 來源廣泛，存在于各種細(xì)菌、真菌和一些高等植物的組織中[1-2]。目前，甲殼素酶多應(yīng)用于生物防治植物病蟲害和降解甲殼素產(chǎn)幾丁寡糖等方面。近年來，越來越多的國內(nèi)外研究學(xué)者致力于研究甲殼素酶，但是野生型的菌株甲殼素酶產(chǎn)量低、活性也低，從而限制了甲殼素酶的實(shí)際應(yīng)用[3]。因此，運(yùn)用基因工程或酶工程等手段將甲殼素酶進(jìn)行克隆表達(dá)、分子改造以提高甲殼素酶的催化活性，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

Huang等[4]成功在大腸桿菌中高效表達(dá)了來源于蠟樣芽孢桿菌的甲殼素酶基因和，重組的甲殼素酶ChiCH和ChiCW通過GST融合標(biāo)簽進(jìn)行純化，純化后的蛋白比酶活分別為7.48 U/mg和3.69 U/mg。隨后又對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行了生物化學(xué)特性的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChiCH為外切甲殼素酶，ChiCW為內(nèi)切甲殼素酶。2017年，Guo等[5]從來源于類芽孢桿菌屬CS0611的菌株中分離純化了一種堿性甲殼素酶，純化后比酶活達(dá)到10.28 U/mg，經(jīng)過HPLC檢測(cè)其水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，該酶可以將膠體甲殼素水解為甲殼二糖。2018年，Zhang等[6]從梅園幾丁質(zhì)分解細(xì)菌SYBC-H1中表達(dá)了一種新型甲殼素酶CmChi1，經(jīng)鑒定屬于糖苷水解酶18家族，通過膠體甲殼素親和層析純化后比酶活達(dá)到15.3 U/mg。CmChi1能水解膠體甲殼素且最終產(chǎn)物為GlcNAc，得率接近100%，產(chǎn)物分離后純度達(dá)到98%。

此外，還有學(xué)者通過分子對(duì)接、定點(diǎn)突變等技術(shù)手段對(duì)甲殼素酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Madhuprakash等[7]對(duì)來源于變形斑沙雷氏菌的甲殼素酶D的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該酶同時(shí)具有水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性，且該酶具有糖苷水解酶18家族的特點(diǎn)，在其催化結(jié)構(gòu)域中存在保守區(qū)域DXDXE結(jié)構(gòu)，這是首次發(fā)現(xiàn)單個(gè)結(jié)構(gòu)域的甲殼素酶同時(shí)具有兩種活性。Fan等[8]通過對(duì)來源于舞毒蛾的甲殼素酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，并對(duì)其活性殘基進(jìn)行了功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型的酶比突變酶具有更高的催化效率，雖然突變位點(diǎn)都為負(fù)突變，但是證明了D143、D145和W146為該酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。

我們?cè)谇捌谘芯恐校ㄟ^信號(hào)肽篩選、核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS) 優(yōu)化和定點(diǎn)突變等手段，獲得了一個(gè)具有較高催化能力的甲殼素酶Chisb，其比酶活達(dá)到249.62 U/mg。研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該酶的最適pH為5.0，最適溫度為60 ℃，m和cat/m分別為2.24 mmol/L和3.9 mmol/(L·s)。通過離子色譜檢測(cè)其水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，以膠體甲殼素為底物，該酶最終可水解得到4種不同聚合度的幾丁寡糖[9]。

如前所述，研究者已經(jīng)運(yùn)用多種手段對(duì)甲殼素酶進(jìn)行了研究。但運(yùn)用易錯(cuò)PCR[10]或DNA改組[11-12]的方式對(duì)甲殼素酶分子進(jìn)行定向改造的研究較少。易錯(cuò)PCR是利用DNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性，在一定條件下 (如不同的dNTPs濃度、Mg2+濃度和MnCl2存在) 能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)突變的一種技術(shù)。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，采用易錯(cuò)PCR技術(shù)將隨機(jī)突變引入來源于芽孢桿菌屬sp. DAU101的甲殼素酶Chisb，經(jīng)過96孔板初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得催化效率進(jìn)一步提高的突變體，為實(shí)現(xiàn)其在高效生物轉(zhuǎn)化合成幾丁寡糖中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600和重組菌株R13NprB-C-SP-H[9]均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pP43NMK_R13NprB--sp-his[9]為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；質(zhì)粒pP43NMK_MR13NprB--sp-his為本研究中構(gòu)建。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

試劑：可調(diào)式易錯(cuò)PCR試劑盒 (CAT#: 160903-100，北京天恩澤基因科技有限公司)；幾丁寡糖標(biāo)準(zhǔn)品 (聚合度1–5) 購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲殼素粉末 (C7170，SIGMA-ALDRICH)；改良型Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司)；NuPAGE?Novex?Bis-Tris預(yù)制凝膠及標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (Thermo Fisher scientific)；氨芐青霉素 (CAS 69-52-3) 和卡那霉素 (CAS 25389-94-0) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其他常用試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基 (Luria-Bertani，LB)：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (Terrific-Broth，TB)：酵母粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油4 mL/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L。

1.3 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增chisb基因片段

以質(zhì)粒pP43NMK_R13NprB--sp-his為模板，擴(kuò)增片段，所用引物如表1所示。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系 (30 μL)：DNA聚合酶 (5 U/mL) 1 μL，10×易錯(cuò)PCR Mix 3 μL，10×dNTPs 3 μL，MnCl24 μL，dGTP 4 μL，易錯(cuò)PCR引物各1 μL，DNA模板1 μL，超純水12 μL。用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件：94 ℃ 3min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

表1 易錯(cuò)PCR引物

1.4 突變文庫的構(gòu)建

使用表1中P43-F和P43-R引物進(jìn)行線性化擴(kuò)增質(zhì)粒pP43NMK_R13NprB--sp-his。用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物?；厥盏钠?、2和載體pP43NMK采用一步克隆試劑盒 (ClonExpress?II，Vazyme Biotech Co.，Ltd) 連接，構(gòu)建突變重組質(zhì)粒pP43NMK_MR13NprB-- sp-his。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與平板菌落PCR鑒定

將突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至JM109中，涂布氨芐青霉素抗性平板，于37 ℃培養(yǎng)8–12 h。待平板長(zhǎng)出菌落后，隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行平板菌落PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的陽性克隆概率。

1.6 96孔板初篩與搖瓶復(fù)篩

將平板上的菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至WB600中，涂布卡那霉素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。待平板長(zhǎng)出菌落后，首先將單菌落接種至96孔板中，用LB培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，8 h后轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)12 h后測(cè)定酶活大小。

將初篩得到的正向突變體進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，培養(yǎng)方法與初篩一致。將復(fù)篩得到的正向突變體送至蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測(cè)序，確定突變位點(diǎn)。

1.7 突變體活性與蛋白濃度的測(cè)定

以膠體甲殼素作為底物測(cè)定酶活大小。500 μL反應(yīng)體系包含66 μL 10%的膠體甲殼素、334 μL 磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液 (pH 5.0) 和純化的突變體的反應(yīng)混合物在60 ℃振蕩15 min后，100 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，14 000 r/min離心5 min[9]。使用改進(jìn)的3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法在540 nm處測(cè)定上清液中還原糖的量[13]。一個(gè)單位的甲殼素酶酶活定義為在60 ℃、pH 5.0的條件下，每小時(shí)釋放1 μmol還原糖所需的酶量。用GlcNAc測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，加熱滅活的酶作為對(duì)照。使用Bradford蛋白含量測(cè)定試劑盒 (Sangon Biotech Co.，Ltd)[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

1.8 突變體純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

1.8.1 突變體純化

將發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液通過0.45 μm濾膜除去雜質(zhì)，以0.1 mL/min的流速直接上樣至His GraviTrap柱 (GE Healthcare，Tokyo)。上樣后，用緩沖液A (40 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5) 平衡柱子，流速為0.2 mL/min。然后用緩沖液B (40 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.5) 從5%–100%進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，最后使用HiTrapTMDesalting脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，純化后的酶液保存在4 ℃以備使用。純化的蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)[15]進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.2 突變體酶學(xué)性質(zhì)研究

為測(cè)定溫度對(duì)突變體酶活性的影響，根據(jù)1.7中突變體酶活的測(cè)定方法，測(cè)定25 ℃–70 ℃等溫度下，突變體的酶活，確定其最適反應(yīng)溫度。

為測(cè)定pH對(duì)突變體酶活性的影響，根據(jù)1.7中突變體酶活的測(cè)定方法，選擇pH 3.0–12.0的各種緩沖液測(cè)定突變體的最適反應(yīng)pH。使用的緩沖液如下：磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液 (pH 3.0–6.0)，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液 (pH 6.0–9.0)，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH 9.0–12.0)。使用的所有緩沖液濃度均為20 mmol/L。

為測(cè)定不同金屬離子對(duì)突變體酶活性的影響，分別用1、5和10 mmol/L的CoCl2、MnCl2、MgCl2、FeCl3、CuCl2、ZnCl2、CaCl2、KCl、AlCl3、BaCl2、NiSO4、C2H3O2Li等金屬離子的鹽溶液在標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定條件下反應(yīng)，以不加金屬離子的反應(yīng)為對(duì)照，研究金屬離子對(duì)突變體酶活的影響。

以不同濃度的膠體甲殼素為底物，測(cè)定突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用Matlab軟件擬合曲線，計(jì)算米氏常數(shù) (m) 和最大反應(yīng)速率 (max)，進(jìn)而推導(dǎo)出特征常數(shù)cat和催化效率比cat/m。

以上所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，并取平均值和方差進(jìn)行計(jì)算。

1.9 高效液相色譜 (HPLC) 分析水解產(chǎn)物

收集12 h的對(duì)照菌株與突變體的發(fā)酵上清液，在3 g/L的底物終濃度下分別于55 ℃反應(yīng)2、4、6、8、10、12、20、24 h。14 000 r/min離心10 min水解后的反應(yīng)液，上清液用于HPLC分析 (Agilent 1260 system，USA)。色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E柱 (4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：乙腈∶水=70∶30；流速是0.6 mL/min，檢測(cè)器用紫外檢測(cè)器 (VWD)，波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用表1的引物擴(kuò)增片段1和2，基因全長(zhǎng)1 692 bp，分為兩段進(jìn)行擴(kuò)增。1片段長(zhǎng)767 bp，2片段長(zhǎng)925 bp，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增1片段的3對(duì)引物中，只有chisb1-F1/R1能擴(kuò)增出目的條帶，其余2對(duì)引物擴(kuò)增都沒有明顯條帶；而用引物chisb2- F2/R2擴(kuò)增2片段的效果沒有chisb2-F1/R1和chisb2-F3/R3引物的擴(kuò)增效果好。所以選用引物chisb1-F1/R1擴(kuò)增1片段，引物chisb2- F1/R1擴(kuò)增2片段，引入隨機(jī)突變位點(diǎn)。

圖1 chisb1和chisb2的凝膠電泳圖

2.2 突變文庫的構(gòu)建及平板鑒定

引物P43-F和P43-R擴(kuò)增得到的線性化質(zhì)粒與回收的1和2片段采用一步克隆試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化JM109，可在氨芐平板上得到約1 000個(gè)單菌落，隨機(jī)挑選100個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小，結(jié)果顯示全部為陽性克隆。隨機(jī)挑選8個(gè)單菌落的驗(yàn)證條帶如圖2所示?？梢钥闯?，片段已成功轉(zhuǎn)入JM109中。將平板上的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至WB600，在卡那霉素平板上長(zhǎng)出約700個(gè)陽性克隆。

2.3 96孔板初篩與搖瓶復(fù)篩結(jié)果

將卡那霉素平板上長(zhǎng)出的約700個(gè)陽性克隆接種于含LB液體培養(yǎng)基的96孔板中，培養(yǎng)8 h后，再轉(zhuǎn)接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，12 000 r/min離心10 min后取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定。結(jié)果顯示，其中24株突變體的酶活高于對(duì)照。將這24株突變體進(jìn)行搖瓶復(fù)篩鑒定，采用同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)和酶活測(cè)定，其中2株突變體的活力顯著高于其他突變體。經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分別是第43位半胱氨酸突變?yōu)樘於彼?(C43D) 和第336位谷氨酸突變?yōu)榫彼?(E336R)。

圖2 基因chisb的凝膠電泳圖

2.4 突變體的純化

為了進(jìn)一步研究突變體的酶學(xué)性質(zhì)，將搖瓶復(fù)篩得到的2個(gè)突變體進(jìn)行了鎳柱純化。結(jié)果如圖3和表2所示。由圖3可以看出，突變體C43D和E336R經(jīng)過鎳柱純化后完全被10%的B液洗脫，在62 kDa處得到一條單一的條帶。由表2可見，經(jīng)過鎳柱純化后的突變體酶與粗酶相比，比酶活都得到了提高，突變體C43D和E336R的純化倍數(shù)分別是之前的3.05倍和3.69倍，得率分別為80.77%和85.45%。

圖3 突變體的SDS-PAGE分析

2.5 突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究

由圖4A可以看出，突變體C43D和E336R的最適溫度都為55 ℃，當(dāng)溫度高于55 ℃，突變體活性迅速降低。圖4B顯示了突變體C43D的最適pH為5.0，pH大于5.0，突變體活性緩慢下降；而E336R的最適pH為9.0，當(dāng)pH在3.0–6.0之間時(shí)，E336R的活性呈上升趨勢(shì)，pH高于6.0活性下降，但在9.0時(shí)活性顯著上升，pH高于9.0又迅速下降。

通過測(cè)定金屬離子對(duì)突變體酶活的影響 (如圖5所示)，發(fā)現(xiàn)15 mmol/L的Mn2+對(duì)兩株突變體的活性具有顯著的促進(jìn)作用，高濃度的Ba2+對(duì)突變體的活性也有促進(jìn)作用。而Ni+、Mg2+、Ca2+和K+對(duì)突變體C43D的活性影響不大，但無論是高濃度還是低濃度的Fe3+、Cu2+和Al3+都對(duì)C43D突變體活性具有抑制作用；與C43D突變株一樣，F(xiàn)e3+、Cu2+和Al3+也會(huì)抑制E336R的活性。除此之外，高濃度的Zn2+也會(huì)抑制其活性。

以膠體甲殼素作為底物，對(duì)兩個(gè)突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也進(jìn)行了測(cè)定。軟件擬合曲線如圖6所示，計(jì)算結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，突變體C43D和E336R的m值降低，說明底物親和力增加；催化常數(shù)cat升高，催化效率cat/m相比對(duì)照分別提高了1.35倍和1.57倍。

2.6 水解產(chǎn)物的HPLC分析

結(jié)果如圖7所示。由圖7A可以看出，對(duì)照 (原始酶) 水解膠體甲殼素生成的幾丁寡糖總量為0.89 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為29.7%，水解產(chǎn)物以(GlcNAc)2為主。而突變體E336R水解膠體甲殼素產(chǎn)生的幾丁寡糖總量始終高于C43D突變體，其催化24 h后幾丁寡糖總量達(dá)到最大，分別為2.53 g/L和2.06 g/L，轉(zhuǎn)化率分別為84.3%和68.7% (圖7B，7C)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體的催化水解產(chǎn)物都為GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)5，但是反應(yīng)8 h之后，檢測(cè)不到 (GlcNAc)3的生成。其中 (GlcNAc)2含量最高，反應(yīng)至24 h時(shí)，C43D和E336R突變體生成的 (GlcNAc)2分別占總糖含量的71.8%和57.7%。

表2 突變體的純化結(jié)果

表3 突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

甲殼素酶在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用。但是野生菌產(chǎn)的甲殼素酶活性較低，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)甲殼素酶有一定差距[16]。隨著對(duì)甲殼素酶研究的深入，研究者多采用在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)的方式生產(chǎn)甲殼素酶[17-19]。除此之外，還對(duì)甲殼素酶的特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的研究。

目前，運(yùn)用易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)突變技術(shù)是對(duì)甲殼素酶進(jìn)行改造的有效方式[20-21]。易錯(cuò)PCR是一種使復(fù)制的DNA序列出現(xiàn)錯(cuò)誤的一種PCR技術(shù)，它通過保真度低的DNA聚合酶，使DNA復(fù)制的保真度降低，從而在合成的新鏈中增加錯(cuò)配的堿基，達(dá)到產(chǎn)物出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)突變的效果[22]。而運(yùn)用易錯(cuò)PCR對(duì)甲殼素酶進(jìn)行定向進(jìn)化，可能成為一種提高甲殼素酶催化活性的有效方式。本研究中，以前期獲得的產(chǎn)甲殼素酶的重組菌R13NprB-C-SP-H為出發(fā)菌株，利用隨機(jī)突變和高通量篩選的方法獲得了底物親和力、催化效率和比活性都明顯提高的甲殼素酶突變體C43D和E336R。

通過對(duì)兩種甲殼素酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，突變體的最適溫度 (55 ℃) 相比未突變的酶 (60 ℃) 要低，突變體在60 ℃時(shí)，活性顯著降低，這可能是位于甲殼素酶催化結(jié)構(gòu)域附近的天冬氨酸，其羧基在高溫下不穩(wěn)定而半胱氨酸的巰基更加穩(wěn)定導(dǎo)致的。比較最適pH發(fā)現(xiàn)，C43D突變體沒有發(fā)生變化，E336R突變體的最適pH為9.0，造成這一現(xiàn)象的原因其一可能是：由于336位的谷氨酸為酸性氨基酸，帶負(fù)電荷，當(dāng)突變?yōu)榫彼岷?，精氨酸為堿性氨基酸，突變后原本結(jié)構(gòu)中的酸性基團(tuán)變?yōu)閴A性基團(tuán)，在pH為9.0的緩沖溶液中，蛋白帶正電荷，在堿性環(huán)境下更穩(wěn)定；其二是由于突變?yōu)锳rg之后，Arg與周圍相鄰的其他氨基酸形成了新的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和鹽橋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致突變體的pH發(fā)生改變[23-24]。而C43D突變體中的天冬氨酸為酸性氨基酸，帶負(fù)電荷，它會(huì)影響斷裂位點(diǎn)周圍電離基團(tuán)的pKa值，在原本酸性的環(huán)境下，使得突變體C43D的最適pH保持不變[25]。除此之外，天冬氨酸在甲殼素酶的催化反應(yīng)中還參與配體的催化和結(jié)合。2012年，Suginta等[26]報(bào)道了來源于哈氏弧菌的甲殼素酶A，其催化結(jié)構(gòu)域附近的Asp313的羧基可以與-乙酰基團(tuán)中的-C=O (羰基) 相互作用，從而使得生成的產(chǎn)物構(gòu)像發(fā)生改變。本研究中43位的半胱氨酸位于甲殼素酶Chisb的催化結(jié)構(gòu)域附近，當(dāng)突變?yōu)樘於彼?，其羧基可以與底物乙酰基團(tuán)中的羰基發(fā)生相互作用，而半胱氨酸的巰基與羰基的相互作用較弱，因此突變后底物親和力增加，說明催化結(jié)構(gòu)域附近的天冬氨酸在甲殼素酶的底物結(jié)合中具有重要作用[27]。

當(dāng)以膠體甲殼素作為底物對(duì)突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)，相比未突變酶的米氏常數(shù) (m) 為2.24 mmol/L，突變體C43D和E336R的m值降低，說明突變體對(duì)底物的親和力增加；特別是突變體E336R，由于精氨酸結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈比谷氨酸的側(cè)鏈長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致底物的結(jié)合口袋變大，增加了酶與底物的結(jié)合能力，更多的底物會(huì)進(jìn)入到底物結(jié)合口袋，因此底物親和力顯著增加；另外，精氨酸結(jié)構(gòu)中所含有的陽離子不會(huì)阻礙底物結(jié)合，底物可以自由進(jìn)入到底物結(jié)合口袋，使底物親和力增加。同時(shí)，突變體的催化效率 (cat/m) 相比未突變的酶的催化效率 (3.9 L/(s·mmol)，也分別提高了1.35倍和1.57倍。分析甲殼素酶Chisb的三維蛋白結(jié)構(gòu)[9,28]，C43D突變體中的天冬氨酸，它可以和幾丁寡糖分子中 (?1) 位的非還原性糖基結(jié)合形成氫鍵，穩(wěn)定甲殼素酶的催化活性；而E336R突變體中的精氨酸與甲殼素酶Chisb周圍相鄰的氨基酸形成了新的鹽橋，從而提高了催化效率[29-30]。

綜上所述，我們的研究證明了隨機(jī)突變結(jié)合高通量篩選技術(shù)是提高甲殼素酶催化效率及其底物親和力的一種有效手段，這為利用甲殼素酶高效生物轉(zhuǎn)化合成幾丁寡糖奠定了一定基礎(chǔ)。

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Directed evolution of chitinase Chisb and biosynthesis of chitooligosaccharides

Mengyan Pan1,2, Xianhao Xu1,2, Yanfeng Liu1,2, Jianghua Li1,2, Xueqin Lü1,2, Guocheng Du1,2, and Long Liu1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China 2 College of Bioengineering, Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

Chitinase has a wide industrial application prospect. For example, it can degrade shrimp shells, crab shells and other crustacean waste into high value-added chitooligosaccharides. However, the low catalytic efficiency of chitinase greatly limits the production of chitooligosaccharides. In previous study, the we expressed a chitinase Chisb with high catalytic efficiency and studied its enzymatic properties. In order to further improve the catalytic efficiency of Chisb, with R13NprB-C-SP-H as the parent, here error-prone PCR was used to construct random mutant library to conduct directed evolution of chitinase Chisb. Two mutants C43D and E336R were obtained with 96-well plate primary screening and shaker-screening, and their enzymatic properties were also studied. The optimum temperature of C43D and E336R was 55 °C, and the optimum pH of C43D was 5.0, while that of E336R was 9.0. The catalytic efficiency of C43D and E336R was 1.35 times and 1.57 times higher than that of control. The chitooligosaccharide concentration of E336R and C43D was 2.53 g/L and 2.06 g/L, improved by 2.84 times and 2.31 times compared with the control (0.89 g/L), respectively. In addition, the substrate conversion rate of mutants E336R and C43D was 84.3% and 68.7%, improved by 54.6% and 39% compared with the control (29.7%), respectively. In summary, the study indicates that random mutation introduced by error-prone PCR can effectively improve the catalytic efficiency of chitinase Chisb. The positive mutants with higher catalytic efficiency obtained in the above study and their enzymatic property analysis have important research significance and application value for the biosynthesis of chitooligosaccharides.

chitinase Chisb,chitooligosaccharides, catalytic efficiency, error-prone PCR, directed evolution

February 20, 2019;

April 2, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31622001, 21808084).

Long Liu. Tel: +86-510-85918312; Fax: +86-510-85918309; E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31622001，21808084) 資助。

2019-04-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190424.1452.002.html

潘夢(mèng)妍, 徐顯皓, 劉延峰, 等. 甲殼素酶Chisb的定向進(jìn)化及生物轉(zhuǎn)化合成幾丁寡糖. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1787–1796.

Pan MY, Xu XH, Liu YF, et al. Directed evolution of chitinase Chisb and biosynthesis of chitooligosaccharides. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1787–1796.

(本文責(zé)編 陳宏宇)