周雪，王怡，何東，曾文，張翀，薛正蓮，邢新會(huì)

口服肝素與小鼠腸道菌群的相互作用

周雪1，王怡2，何東2，曾文2，張翀2，薛正蓮1，邢新會(huì)2

1 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000 2 清華大學(xué) 化學(xué)工程系生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心，北京 100084

口服肝素藥物的開(kāi)發(fā)需要系統(tǒng)地理解口服肝素與腸道菌群之間的互作過(guò)程。通過(guò)熒光體視鏡觀察熒光素標(biāo)記的肝素經(jīng)小鼠口服后在體內(nèi)的分布情況，利用高效液相色譜法檢測(cè)肝素在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性和體外培養(yǎng)腸道菌群模擬腸道菌對(duì)肝素的降解作用，發(fā)現(xiàn)口服肝素主要分布在小鼠胃腸道內(nèi)，在體外模擬胃腸液條件下肝素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但能夠被添加肝素的厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后的腸道菌群降解。為了進(jìn)一步揭示口服肝素對(duì)健康小鼠腸道菌群的影響，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定口服肝素后C57BL/6J小鼠糞便菌群的16S rRNA序列，與口服生理鹽水的小鼠糞便菌群進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)口服肝素的小鼠糞便菌群的生物多樣性降低；在門水平上，菌群結(jié)構(gòu)差異不顯著；而在屬水平上，別樣桿菌屬、副薩特氏菌屬和艾克曼菌屬相對(duì)豐度增高，而嗜膽菌屬、腸桿菌屬、瘤胃梭菌屬、普雷沃氏菌科、瘤胃梭菌屬、擬桿菌屬、、和的相對(duì)豐度減少，表明口服肝素能夠影響小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口服肝素對(duì)小鼠無(wú)明顯毒副作用，具有較高安全性。研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)肝素口服遞送策略提供新的思路，為口服肝素類藥物的開(kāi)發(fā)提供參考。

肝素，口服，腸道菌群，降解，胃腸道

肝素是一種天然存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的線性多糖大分子，屬于糖胺聚糖家族。其結(jié)構(gòu)中含有3-O-硫酸基的特殊五糖結(jié)構(gòu)，能特異性結(jié)合血液中的AT III，從而使肝素具有抗凝活性[1-4]。肝素作為抗凝血藥物應(yīng)用于臨床已有80多年的歷史，目前低分子量肝素是臨床上應(yīng)用最廣泛的抗凝血藥物之一。在臨床應(yīng)用中，肝素類藥物以靜脈或皮下注射給藥途徑為主，尚未見(jiàn)口服肝素類藥物上市。由于肝素口服制劑不僅能減少通過(guò)注射給藥的疼痛和不適，而且還有可能減少住院時(shí)間，有更好的患者依從性，因此口服肝素類藥物的開(kāi)發(fā)具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

通常認(rèn)為肝素分子量大、帶強(qiáng)負(fù)電、極性強(qiáng)等特性是導(dǎo)致肝素口服生物利用度低的主要原 因[5]。根據(jù)這些特性，以往的研究者已經(jīng)嘗試使用多種藥物遞送劑改善口服肝素經(jīng)胃腸道吸收困難的問(wèn)題，包括制備肝素綴合脫氧膽酸形成復(fù)合物[6-7]、脂質(zhì)體[8]、油-水乳劑以及與聚合物和納米顆粒結(jié)合等修飾方式研制腸溶肝素制劑等[9-11]。但是有關(guān)口服肝素在體內(nèi)的吸收代謝途徑及其與腸道菌群的相互作用目前仍不明確。在大鼠靜脈和動(dòng)脈血栓形成模型中，肝素經(jīng)口服給藥后能在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)肝素存在，并且檢測(cè)到顯著的抗血栓活性[12-13]，表明口服肝素在體內(nèi)能被內(nèi)皮吸收發(fā)揮作用。關(guān)于口服肝素體內(nèi)分布的研究中，通過(guò)口服給與小鼠熒光標(biāo)記的?；悄懰?TCA)與肝素和多西紫杉醇(DTX) 連接后的結(jié)合物，分析其在體內(nèi)的分布發(fā)現(xiàn)該類肝素結(jié)合物能夠到達(dá)小鼠結(jié)腸部位[7]。通過(guò)口服給予大鼠0.025–15 mg/kg的亭扎肝素后，未能在給藥后24 h內(nèi)的糞便中檢測(cè)出肝素[14]?？诜o予狗7.5 mg/kg的肝素膠囊24 h后，結(jié)果只在1只狗的糞便中檢測(cè)到了肝素，而在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的其他狗的糞便中均未檢測(cè)到肝 素[15]。關(guān)于口服肝素后糞便中未檢測(cè)到肝素，與胃腸道對(duì)口服肝素的消化降解作用以及糞便中肝素檢測(cè)方法靈敏度相關(guān)。因此考察消化道對(duì)口服肝素的影響，需要了解口服肝素在胃液、小腸液和結(jié)腸液環(huán)境中的穩(wěn)定性以及腸道菌群對(duì)肝素的降解能力。

解析口服肝素的體內(nèi)活性以及生物利用度面臨的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是闡明肝素與腸道菌群的相互作用。由于肝素糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及高度硫酸化特性使其不易被降解，目前已知肝素酶可以通過(guò)識(shí)別特定底物裂解位點(diǎn)破壞糖苷鍵降解肝素[16]，定殖于人體的多形擬桿菌能夠利用自身編碼的糖苷水解酶(GH)/多糖裂解酶(PL) 和硫酸酯酶協(xié)同作用克服糖胺聚糖的硫酸化問(wèn)題降解肝素[17]，在厚壁菌門的大型基因組研究中發(fā)現(xiàn)存在一類可能有助于肝素代謝的GH或PL位點(diǎn)[18]。通過(guò)分析腸道菌群降解肝素的能力，考察腸道菌群對(duì)口服肝素穩(wěn)定性和抗凝活性的影響，為進(jìn)一步解析口服肝素在消化道內(nèi)的代謝和吸收提供基礎(chǔ)。關(guān)于肝素對(duì)腸道菌群影響的研究中，Duan等[19]利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)，探索了口服肝素兩周后的小鼠腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)與口服生理鹽水的小鼠相比，口服肝素的小鼠糞便菌群中的乳桿菌變多而腸球菌減少，暗示口服肝素會(huì)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。但是該研究?jī)H采用PCR-DGGE進(jìn)行了菌群解析，能得到的信息有限，無(wú)法全面揭示口服肝素對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。

綜上所述，雖然目前的研究初步揭示了口服肝素在有些條件下能夠進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的現(xiàn)象，但大部分研究尚處在探索階段，僅就口服肝素在體內(nèi)不同臟器內(nèi)的分布進(jìn)行了探索，而且不同研究采用的肝素形態(tài)和動(dòng)物模型不同，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有獲得面向口服藥物研制的統(tǒng)一結(jié)論，對(duì)口服肝素在胃腸內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及其與腸道菌群的相互作用過(guò)程的系統(tǒng)研究還很初步。因此，需要不斷建立全面解析肝素在動(dòng)物體內(nèi)分布及其作用機(jī)制的方法。為了系統(tǒng)地揭示口服肝素在胃腸道的變化及其與腸道菌群的互作，本研究采用健康小鼠作為動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)熒光肝素在小鼠體內(nèi)的分布和在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性，建立體外檢測(cè)腸道菌群對(duì)肝素降解作用的評(píng)價(jià)方法，并結(jié)合Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)研究口服肝素對(duì)健康小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

本研究的意義在于通過(guò)分析口服肝素在健康模式動(dòng)物胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，分析可能影響口服肝素發(fā)揮作用的因素，為未來(lái)進(jìn)一步研究口服肝素遞送藥物增加肝素在體內(nèi)的吸收提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝素(河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，原料藥級(jí)，Mw：(16 430±40) Da，抗Xa因子活性：(191.8±5.7) IU/mg)、厭氧肉湯培養(yǎng)基(青島海博生物科技有限公司)、氯化血紅素(上海阿拉丁試劑有限公司)、維生素K1 (上海阿拉丁試劑有限公司)、糞便基因組提取試劑盒(DP328-02，天根生化科技有限公司)、采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(DP302-02，天根生化科技有限公司)、疊氮化鈉(色譜純，Biotopped公司)、無(wú)水硫酸鈉(色譜純，Sigma公司)、TSK-GEL G2000SWXL (TOSOH公司)、C57BL/6J小鼠(清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買)。

1.2 方法

1.2.1 熒光肝素在體內(nèi)代謝分布測(cè)定

熒光肝素制備：將肝素溶液(100 mg/mL)、Texas Red酰肼(Thermo Fisher Scientific公司，100 mg/mL溶于DMSO) 和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，20 mg/mL) 按 10︰3︰3比例混合后，室溫避光孵育2 h，再添加少量EDC (總濃度1 mg/mL)，過(guò)夜孵育，利用3.5 kDa透析袋徹底透析除鹽并凍干后得到Texas Red標(biāo)記的肝素。

C57BL/6J雄性小鼠(周齡：6–8周) 購(gòu)自清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠為無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，在清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，溫度控制為(22.5±2.5) ℃，濕度控制為50%±5%。在C57BL/6J雄性小鼠禁食24 h后，口服給與熒光肝素溶液(25 mg/kg) 10 h后，眼眶取血并斷頸處死小鼠后進(jìn)行解剖，采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸和結(jié)腸組織樣品，在4 ℃ PBS緩沖液中短暫儲(chǔ)存，之后使用熒光體視鏡觀察上述組織中的熒光肝素分布情況，實(shí)驗(yàn)中使用錫箔紙封好的離心管以避光保存小鼠器官。

1.2.2 肝素胃腸液穩(wěn)定性測(cè)定

配制模擬胃液和模擬小腸液，模擬胃液(SGF)：胃蛋白酶1.6 g，氯化鈉2.0 g，HCl調(diào)至pH 1.2，用容量瓶定容至500 mL。模擬小腸液(SIF)：腸液素10.0 g，磷酸二氫鉀6.8 g，NaOH調(diào)pH至6.8，用容量瓶定容至500 mL。模擬結(jié)腸液：腸液素10.0 g，磷酸二氫鉀6.8 g，NaOH調(diào)至pH 7.2，用容量瓶定容至500 mL。按30 mg/mL的終濃度稱取適量肝素粉末，分別溶解于對(duì)應(yīng)體積的模擬胃液、腸液和結(jié)腸液中，分別移取各溶液2 mL至標(biāo)記好的離心管中，37 ℃孵育并在不同時(shí)間收獲對(duì)應(yīng)的離心管，100 ℃下水浴5 min后，10 000 r/min離心10 min取1.5 mL上清液，用 0.45 μm濾頭過(guò)濾，將濾液冷凍干燥后測(cè)定肝素分子量變化。

1.2.3 肝素分子量測(cè)定

采用歐洲藥典規(guī)定的凝膠滲透色譜法測(cè)肝素分子量。使用WATERS液相檢測(cè)系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器和示差檢測(cè)器串聯(lián)、TSK-GELG2000SWXL (7.8 mm×300 mm，TOSOH，日本) 進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件如下，流速：0.5 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm，時(shí)間：40 min，流動(dòng)相：28.4 g/L無(wú)水硫酸鈉溶液，pH 5.0±0.1。

1.2.4 糞便菌懸液制備

向40 mL PBS溶液中加入20 mg半胱氨酸鹽酸鹽充分溶解后121 ℃滅菌15 min，配制成無(wú)菌預(yù)還原PBS溶液。在清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的超凈工作臺(tái)內(nèi)取5粒新鮮小鼠糞便，迅速放入含有1 mL無(wú)菌預(yù)還原PBS溶液的離心管中，冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。用螺旋振蕩器將糞便混勻制成菌懸液，4 ℃、1 000 r/min瞬時(shí)離心2次，取上清液作為接種菌懸液。

1.2.5 小鼠腸道菌群的體外培養(yǎng)

稱取60 g厭氧肉湯培養(yǎng)基(GAM) 溶于 1 000 mL蒸餾水中使其充分溶解后，按60 mL/ 250 mL分裝于厭氧培養(yǎng)瓶中，121 ℃滅菌15 min，按0.05%的終濃度分別加入過(guò)濾除菌后的維生素K1溶液與氯化血紅素溶液配制成厭氧肉湯培養(yǎng)基。向其中再加入過(guò)濾除菌的肝素溶液配制成含有0.5%的肝素厭氧肉湯培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)中向厭氧瓶培養(yǎng)瓶中通氮?dú)庖匀コ恐械难鯕?，用無(wú)菌注射器按照0.5% (體積比) 的接種量取接種菌懸液進(jìn)行接種，在恒溫?fù)u床中，37 ℃、200 r/min下厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.6 體外培養(yǎng)腸道菌基因組DNA提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取腸道菌基因組，嚴(yán)格按照試劑盒里的實(shí)驗(yàn)步驟逐步操作，得到的核酸樣品使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA完整性。

1.2.7 PCR擴(kuò)增腸道菌群肝素酶基因

在Brenda酶庫(kù)搜索肝素酶并獲取基因序列，根據(jù)基因序列信息設(shè)計(jì)了7對(duì)引物，以體外培養(yǎng)的腸道菌基因組為模板，以表1中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖電泳和Gel Extraction kit (D2500-01，OMEGA BIO-TEK公司) 純化回收序列大小正確的擴(kuò)增序列，送至南京金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.8 肝素抗凝活性測(cè)定

肝素的抗凝血活性通過(guò)使用APTT活化部分凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒(R3018，Sysmex公司) 以及抗Xa活性測(cè)定試劑盒(82098539，Chromogenix公司，發(fā)色底物法) 進(jìn)行檢測(cè)，具體方法參考?xì)W洲藥典藥品標(biāo)準(zhǔn)EP7.0及葉逢春博士論文方法[20]。

1.2.9 腸道菌群體外共孵育肝素底物

配制肝素底物緩沖液(100 mL)：Tris 0.208 7 g、NaCl 0.257 4 g、無(wú)水氯化鈣0.007 77 g，肝素1.0 g，HCl調(diào)至pH 7.0±0.1。

將厭氧培養(yǎng)48 h后的20 mL菌液移入離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min取沉淀，再用PBS緩沖液清洗菌體2次，將得到的菌體與肝 素底物緩沖液在30 ℃下共孵育3 h，孵育完畢后13 000 r/min離心20 min，取上清低溫冷凍干燥后，用高效液相色譜儀檢測(cè)肝素分子量變化。

1.2.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及糞便取樣

將C57BL/6J雄性小鼠(周齡：6–8周) 隨機(jī)分成兩組即灌胃生理鹽水組(WT組) 和灌胃肝素組(HP組)，每組10只。按30 mg/(kg·d)的肝素劑量連續(xù)給小鼠灌胃30 d，對(duì)照組小鼠灌胃生理鹽水，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有小鼠均可任意飲水與飲食。給藥期間記錄小鼠體重變化，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中 心的超凈工作臺(tái)內(nèi)采集每只小鼠灌胃后的第10、20、30天的新鮮糞便樣本，每次采集糞便后迅速置入標(biāo)記過(guò)的1.5 mL無(wú)菌離心管內(nèi)置于冰盒中，在實(shí)驗(yàn)室–80 ℃冰箱中儲(chǔ)存直至分析。

1.2.11 糞便樣本基因組DNA提取

使用糞便基因組提取試劑盒提取糞便菌群基因組，嚴(yán)格按照試劑盒里的實(shí)驗(yàn)步驟逐步操作，得到的核酸樣品使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定含量，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA完整性。

1.2.12 16S rRNA微生物群落分析

通過(guò)測(cè)定16S rRNA中的V3–V4區(qū)序列，對(duì)小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序工作由GENEWIZ公司(蘇州，中國(guó)) 完成。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于操作分類單元(Opetational taxonomic unit，OTU) 分析，使用 VSEARCH (1.9.6) 進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)，用參考數(shù)據(jù)庫(kù)Silva 132比對(duì)16S rRNA。然后用RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，之后分析樣本的Alpha多樣性和Beta多樣性，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。

1.2.13 結(jié)腸長(zhǎng)度、脾重指數(shù)與組織學(xué)分析

給藥周期結(jié)束后，給予小鼠安樂(lè)死，并解剖小鼠獲得全段結(jié)腸組織，用標(biāo)尺測(cè)量小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度后，取一部分結(jié)腸組織置于10%福爾馬林中固定，之后制作腸組織石蠟切片，再對(duì)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，通過(guò)顯微鏡觀察拍照。另取小鼠脾臟，在分析天平上測(cè)定濕重并記錄，計(jì)算出脾重指數(shù)，即脾重指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)。結(jié)果以mg/10 g體重表示。

表1 肝素酶引物序列

1.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均有生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。生物統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異使用Origin Lab軟件(Origin Pro 8.0，Origin Lab Co，Northampton，MA，USA) 進(jìn)行單向方差分析(ANOVA)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服熒光肝素的小鼠體內(nèi)分布

使用熒光體式鏡分別觀察口服灌胃熒光肝素10 h后，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸和結(jié)腸的熒光肝素分布情況。如圖1所示，熒光肝素主要分布在小鼠的胃、小腸的食糜中以及結(jié)腸部位(圖1A)；而在小鼠的心、肝、脾、肺、腎的剖面并未觀察到熒光肝素的存在(圖1B)，同時(shí)血清中也未檢測(cè)到熒光肝素信號(hào)。表明口服肝素10 h后肝素主要集中存在于胃腸道中，未經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入到腸外其他臟器中。由此可以推測(cè)，小鼠口服肝素后，胃腸道環(huán)境是影響口服肝素代謝與穩(wěn)定性的主要因素之一，因此需要了解口服肝素在胃腸道環(huán)境中的存在特性。

圖1 熒光肝素在小鼠體內(nèi)不同組織中的分布

2.2 肝素在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)使用的肝素為未分級(jí)肝素，是一種分子量不均一的混合物，色譜峰分布較寬，保留時(shí)間為13.8 min (圖2A)。通過(guò)灌胃給藥肝素后肝素首先進(jìn)入胃環(huán)境，其主要特點(diǎn)是酸性較強(qiáng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在模擬胃液中消化12 h的肝素色譜峰的保留時(shí)間和峰面積均未變化(圖2B)，說(shuō)明肝素在模擬胃液環(huán)境中比較穩(wěn)定，肝素分子量無(wú)明顯變化。此外，在模擬小腸液條件下消化12 h的肝素色譜峰的保留時(shí)間和峰面積也沒(méi)有變化(圖2C)，表明肝素在模擬小腸液條件下穩(wěn)定性較好。最后，肝素在模擬結(jié)腸液條件下消化24 h內(nèi)的色譜峰的保留時(shí)間和峰面積沒(méi)有改變(圖2D)，表明肝素在模擬結(jié)腸液環(huán)境中穩(wěn)定性高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模擬胃液、小腸液和結(jié)腸液對(duì)肝素的穩(wěn)定性影響較小，暗示口服肝素能夠穩(wěn)定到達(dá)結(jié)腸部位。

2.3 腸道菌群體外降解肝素的特性

考慮到上述模擬胃腸液為無(wú)菌狀態(tài)，而現(xiàn)實(shí)小鼠腸道特別是結(jié)腸段存在大量腸道菌群，因此探究口服肝素在小鼠腸道內(nèi)的代謝，需要考察肝素與腸道菌群的互作關(guān)系。由于腸道內(nèi)環(huán)境十分復(fù)雜，結(jié)腸內(nèi)存在種類繁多且宿主難以消化的復(fù)雜多糖，會(huì)對(duì)低劑量肝素檢測(cè)產(chǎn)生較大的影響，且目前尚未建立檢測(cè)腸道內(nèi)和糞便中肝素的有效分析方法。因此，我們通過(guò)體外培養(yǎng)糞便菌群的方法，間接推測(cè)結(jié)腸中腸道菌群對(duì)肝素的影響。在體外使用添加肝素的厭氧肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)糞便菌群，收集并測(cè)定培養(yǎng)0、2、6、24 h時(shí)培養(yǎng)液中的肝素，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的肝素色譜峰保留時(shí)間一致。但是在同樣的樣品制備條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不同培養(yǎng)液中的肝素峰面積逐漸減小(圖3A)，表明肝素能被厭氧瓶中培養(yǎng)的腸道菌群降解。與添加肝素的厭氧肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)的腸道菌群細(xì)胞體外共孵育后的肝素色譜圖明顯右移，保留時(shí)間增大，肝素分子量變小，出現(xiàn)與低分子肝素色譜圖相似的寡糖色譜峰(圖3 B)，進(jìn)一步表明體外培養(yǎng)的腸道菌群可以利用肝素且能將大分子肝素降解為小分子肝素。由此推測(cè)，體外培養(yǎng)的小鼠腸道菌群中存在能夠降解肝素的菌屬，暗示腸道菌群會(huì)對(duì)口服肝素產(chǎn)生影響。

圖2 肝素在模擬胃腸液中的高效液相色譜圖

為了進(jìn)一步獲得培養(yǎng)菌群降解肝素的分子證據(jù)，進(jìn)一步提取體外培養(yǎng)的腸道菌群基因組(圖4 A)，利用肝素酶引物對(duì)該基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到擴(kuò)增后的DNA電泳條帶(圖4B)。并對(duì)DNA進(jìn)行回收、純化與測(cè)序后，在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，其中A引物擴(kuò)增得到的序列與多形擬桿菌7330編碼的肝素酶Ⅱ()相似度達(dá)99% (Sequence ID: CP012937.1)，G引物擴(kuò)增得到的序列與解纖維素?cái)M桿菌WH2編碼的肝素酶Ⅱ()相似度達(dá)97% (Sequence ID: CP012801.1)。肝素酶Ⅱ是以肝素和硫酸乙酰肝素為底物，裂解2-O硫酸化的糖醛酸的典型肝素酶。上述結(jié)果進(jìn)一步證明體外培養(yǎng)的腸道菌群中可能存在產(chǎn)生肝素酶Ⅱ的菌群，從而發(fā)揮了降解肝素的作用。此外，為研究腸道菌群降解后的肝素抗凝活性變化，檢測(cè)了被體外培養(yǎng)的腸道菌群降解后肝素的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT) 和抗Xa因子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原肝素相比，其抗凝活性沒(méi)有明顯下降趨勢(shì)仍具有抗凝活性(表2)，說(shuō)明培養(yǎng)腸道菌群降解后的肝素仍有抗凝活性，該結(jié)果為口服抗凝肝素研制提供了參考。

圖3 肝素體外降解色譜圖

圖4 細(xì)菌基因組及PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 口服肝素對(duì)健康小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 口服肝素對(duì)健康小鼠腸道菌群的總體結(jié)構(gòu)影響

本文通過(guò)測(cè)定糞便菌群的16S rRNA的V3–V4區(qū)，分析第10、20、30天的HP組與WT組小鼠的糞便菌群差異。在移除不合格序列后，每個(gè)樣品平均獲得約70 000–90 000萬(wàn)條序列信息。根據(jù)97%的序列相似性分析，在不同時(shí)間點(diǎn)的WT組和HP組中都鑒定出435個(gè)以上的OTUs，測(cè)序數(shù)據(jù)量相同時(shí)，在灌胃第10、20、30天時(shí)HP組OTUs數(shù)目均高于WT組(表3)。對(duì)于不同組中的所有樣品序列，Goods_coverage較高幾乎完全覆蓋(表3)，表明該測(cè)序方法可以表征腸道菌群的真實(shí)組成。分析Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)，在灌胃第10、20、30天時(shí)HP組與WT組相比差異不顯著，但在灌胃第10天時(shí)與WT組相比HP組中Shannon和Simpson值顯著下降(<0.05)。以上結(jié)果表明，灌胃肝素對(duì)健康小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)有影響。

表2 經(jīng)體外培養(yǎng)腸道菌群降解后肝素抗凝活性

FL: fiducial limit.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，應(yīng)用了Venn圖解分析，主坐標(biāo)分析(PCoA) 和聚類分析(圖5)。如圖5A所示，大部分OTUs是WT組和HP組共有的，少數(shù)是各自獨(dú)特的OTUs，其中灌胃30 d后的小鼠特有的OTUs數(shù)最多。PCoA評(píng)分圖揭示了HP組小鼠的腸道菌群與WT組相比存在差異，但相同處理不同天數(shù)的小鼠的微生物群差異較小(圖5B)。聚類分析也表明WT組和HP組微生物群之間存在差異性(圖5C)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了灌胃肝素能在一定程度上調(diào)節(jié)健康C57BL/6J小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

表3 不同灌胃時(shí)間的HP組及WT組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)

圖5 灌胃肝素對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)影響

2.4.2 灌胃肝素對(duì)小鼠腸道菌群中特定菌屬的影響

為了分析HP灌胃后的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，在門和屬水平上比較了灌胃不同時(shí)間HP組和WT組小鼠的菌群結(jié)構(gòu)差異。如圖6A所示，在門水平上，WT組和HP組小鼠腸道菌群中優(yōu)勢(shì)菌門組成無(wú)差異，主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門和放線菌門等菌門構(gòu)成。在第30天時(shí)HP組和WT組中擬桿菌門相對(duì)豐度均有增高趨勢(shì)，但是差異不顯著。在門水平上，相同時(shí)間點(diǎn)HP組與WT組間菌群沒(méi)有顯著差異，通過(guò)對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的WT組和HP組內(nèi)樣品進(jìn)行LEfSe分析，在屬水平上發(fā)現(xiàn)了兩組中分別對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性影響較大的微生物。圖6B、6C和6D中顯示了灌胃后第10、20、30天時(shí)WT組和HP組內(nèi)的樣本基于LDA分值分析得到的柱狀圖，柱狀圖中展示了兩個(gè)組別中分別對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異貢獻(xiàn)較大的標(biāo)志性微生物。由圖6B所示，在灌胃第10天時(shí)WT組與HP組腸道菌群存在一定差異，HP組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物主要是來(lái)自變形菌門Proteobacteria中的、疣微菌門Verrucomicrobia中的和等，WT組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物是、羅斯氏菌屬、、顫桿菌克屬、厭氧棍狀菌屬和；由圖6C所示，在灌胃20 d時(shí)HP組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的優(yōu)勢(shì)菌為丁酸弧菌屬、、r和，而WT組中的優(yōu)勢(shì)菌為、以及；在灌胃30 d時(shí)發(fā)現(xiàn) (圖6D)，在HP組對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的和等豐度升高，而、和_等豐度降低。說(shuō)明口服肝素能夠改變小鼠腸道中某些菌屬的相對(duì)豐度，對(duì)健康C57BL/6J小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有調(diào)節(jié)作用。

圖6 灌胃肝素在門和屬水平對(duì)腸道菌群的影響

2.5 口服肝素的體內(nèi)藥物安全性

分別檢測(cè)連續(xù)灌胃30 d肝素和灌胃生理鹽水后健康小鼠的體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、脾重指數(shù)和結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化，初步分析口服肝素的生物安全性。如圖7A所示，HP組與WT組的小鼠體重變化趨勢(shì)一致。通過(guò)測(cè)定WT組和HP組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度以及觀察結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)HE染色切片，分析口服肝素對(duì)小鼠結(jié)腸的宏觀結(jié)構(gòu)影響。發(fā)現(xiàn)WT組與HP組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖7B)。HP組與WT組小鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)相似，腸粘膜完整無(wú)脫落，隱窩結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常(圖7C)，提示長(zhǎng)期口服肝素對(duì)小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。脾重指數(shù)是粗略反映機(jī)體免疫能力強(qiáng)弱的指標(biāo)，如圖7D所示，灌胃肝素30 d后HP組與WT組的脾重指數(shù)也無(wú)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明口服灌胃肝素30 d對(duì)小鼠的免疫功能無(wú)明顯影響。以上結(jié)果均表明口服肝素對(duì)健康小鼠具有較高安全性。

圖7 口服肝素對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響

3 討論

本研究首先通過(guò)體外菌群培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)合高效液相色譜法等現(xiàn)代儀器分析手段以及Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)肝素和腸道菌群的相互作用過(guò)程進(jìn)行分析，初步探究了腸道菌群對(duì)肝素的降解作用和口服肝素對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝素在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性高，不易被降解。之前的研究也表明肝素中糖苷鍵不易被酸水解，其中的O-硫酸基對(duì)酸水解相當(dāng)穩(wěn)定，而在堿性條件下，N-硫酸基相當(dāng)穩(wěn)定[21-22]。實(shí)驗(yàn)證明肝素能夠被體外培養(yǎng)的腸道菌群降解，目前相關(guān)代謝組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)糞便菌群能夠編碼豐富多樣的復(fù)雜多糖降解酶，特別是擬桿菌門中的菌屬[23]。通過(guò)檢測(cè)體外培養(yǎng)的腸道菌群降解后的肝素的抗凝血活性，發(fā)現(xiàn)降解前后肝素抗凝活性變化較小，這與前人研究報(bào)道提及的經(jīng)肝素酶Ⅱ和Ⅲ降解的肝素仍有抗凝活性的結(jié)果一致[24]。這一結(jié)果表明，盡管腸道菌群能夠降解口服肝素，但其抗凝活性仍能夠保持，為未來(lái)口服肝素藥物遞送策略的研究提供了參考。

體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明口服熒光標(biāo)記的肝素主要分布在小鼠胃腸道內(nèi)，這與之前一項(xiàng)口服熒光肝素復(fù)合物在體內(nèi)代謝研究結(jié)果一致，熒光肝素主要在回腸積累，在結(jié)腸中也有分布[7]。分析糞便菌群的16S rRNA序列發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期口服肝素的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與WT組相比灌胃肝素后小鼠的腸道菌群多樣性降低；在屬水平上，口服肝素使腸道菌群中的某些菌屬，如、、、、和的相對(duì)豐度增加?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)菌屬能夠產(chǎn)生琥珀酸，細(xì)菌來(lái)源的琥珀酸鹽通過(guò)促進(jìn)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌的定殖，對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用[25]；其中的和菌屬中的某些菌屬被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸[26-28]；而菌屬中的被認(rèn)為是一種很有前景的益生菌，能夠降解腸粘蛋白生成短鏈脂肪酸[29]，與肥胖、糖尿病、心臟代謝疾病和低度炎癥呈負(fù)相關(guān)[30-31]，另外還有研究發(fā)現(xiàn)它能粘附于腸上皮細(xì)胞并在體外增強(qiáng)腸上皮單層細(xì)胞完整性，增強(qiáng)受損腸道的屏障功能[32]?？诜嗡睾?、菌屬的相對(duì)豐度減少。其中被發(fā)現(xiàn)在前驅(qū)糖尿病患者體內(nèi)豐度增高[33]；菌屬中的沃氏嗜膽菌是一種能夠引起和加重炎癥的致病菌[34-35]。

最后，在口服肝素生物安全性方面，本研究表明長(zhǎng)時(shí)間口服肝素沒(méi)有對(duì)小鼠的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯負(fù)面影響，表明口服肝素安全性高。這與Kim等[36]用低分子量肝素-脫氧膽酸鹽結(jié)合物對(duì)小鼠口服毒性研究結(jié)果一致，該研究中沒(méi)有造成小鼠的體征參數(shù)以及死亡率的變化，通過(guò)延長(zhǎng)給藥時(shí)間至4周小鼠也無(wú)死亡和體重下降現(xiàn)象。綜上所述，口服灌胃肝素能夠被腸道菌群降解，能夠在一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，這可能與口服肝素的生物利用度和體內(nèi)生物活性的發(fā)揮有關(guān)，為未來(lái)口服肝素類藥物的開(kāi)發(fā)及藥效解析提供參考。

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Interaction between orally administrated heparin and intestinal microbiota in mice

Xue Zhou1, Yi Wang2, Dong He2, Wen Zeng2, Chong Zhang2, Zhenglian Xue1, and Xinhui Xing2

1,,241000,,Key Laboratory of Industrial Biocatalysis of Ministry of EducationInstitute of Biochemical EngineeringDepartment of Chemical EngineeringCenter for Synthetic and Systems BiologyTsinghua UniversityBeijingChina

The development of orally administrated heparin drugs requires a systematic understanding of the interaction between heparin and gut flora. Thedistribution of fluorescein-labeled heparin that is orally administrated by mice was observed using fluorescein microscopy. In addition, the stability of heparin in simulated gastric and intestinal fluids, as well as thedegradation of heparin by gut flora were detected by HPLC. The results show that orally administrated heparin was mainly distributed in the gastrointestinal tract of mice, and exerted structural stability under the condition of simulated gastric and intestinal fluids. However, heparin could be degraded by intestinal flora cultured in medium containing heparin. In order to further study the effect of orally administrated heparin on intestinal flora in mice, the fecal microbiota 16S rRNA fragment of C57BL/6J mice was tested by the Illumina Mi-Seq high-throughput sequencing technology. Compared with the gut flora of mice that orally administrated by saline, the biodiversity of gut flora in mice with orally administrated heparin was decreased. The difference of microflora structure was not significant at the phylum level, and the relative abundance of,andwas increased at the genus level, and the relative abundance of,,,,,,,,,andwas reduced. These findings indicate that heparin could influence the gut flora of mice. In addition, no obvious toxic and side effects were found in mice that orally administrated heparin, suggesting the safety of orally administrated heparin.

heparin, oral administration, gut microbiota, degradation, gastrointestinal tract

April 19, 2019;

June 6, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 8161101047).

s: Zhenglian Xue. Tel/Fax: +86-533-2871254; E-mail: xuezl@ahpu.edu.cn

Xinhui Xing. Tel/Fax: +86-10-62772249; E-mail: xhxing@tsinghua.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 8161101047) 資助。

2019-07-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190718.1550.001.html

周雪, 王怡, 何東, 等. 口服肝素與小鼠腸道菌群的相互作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1736–1749.

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(本文責(zé)編 郝麗芳)