何 清，李 敏，唐文誠，易輝燕，王 蕾，王繼生,

[1. 西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2. 綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心)，四川 綿陽 621000]

隨著科學技術和社會的發(fā)展，電離輻射損傷受到人們的廣泛關注，如工業(yè)輻射、醫(yī)療輻射、人工輻射以及天然來源的輻射，包括太陽、宇宙射線、地殼中存在的放射性核素等[1]。電離輻射主要是一種由高速帶電的粒子(α、β、質(zhì)子)和不帶電的粒子(X射線、γ射線、中子)產(chǎn)生[2]。電離輻射可引起放射性疾病，其中以消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和造血器官的反應最為明顯[3]。電離輻射損傷的主要靶點是DNA。輻射可使自由基電產(chǎn)生增加、重要功能基團破壞、蛋白質(zhì)和膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化,輻射可激活細胞的凋亡程序?qū)е录毎蛲鯷4]。此外，過量的輻射還會造成基因突變、致癌、致畸等[5]。

脾臟是機體免疫系統(tǒng)中最大的免疫器官，具有大量的B淋巴細胞和巨噬細胞，脾臟可產(chǎn)生免疫球蛋白和補體蛋白等免疫物質(zhì)，從而發(fā)揮免疫功能[6]。脾臟對電離輻射敏感，是輻射損傷最常見的器官之一。電離輻照可致免疫系統(tǒng)的細胞、組織、器官受損。2 Gy X射線全身照射小鼠后，可誘導小鼠脾臟出現(xiàn)典型的淋巴細胞凋亡，使脾臟白髓及紅髓的細胞凋亡均增加[7]。電離輻照破壞DNA雙鏈，間接產(chǎn)生活性氧，使小鼠B淋巴細胞凋亡，可能是導致脾臟組織受損的重要原因[8]。因此，研究電離輻射對小鼠脾臟組織損傷具有重要意義。比較蛋白質(zhì)組學是蛋白質(zhì)組學中的重要研究策略，通過對整體蛋白質(zhì)表達變化的分析，從而發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組間的差異蛋白[9]。ITRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術可對多達8種樣品進行定量研究，可同時分離和篩選成百上千的差異蛋白，最大化的獲得蛋白質(zhì)的生物學功能[10]。

1 材料

1.1 實驗動物清潔級昆明種♂小鼠20只，體質(zhì)量(20±2)g，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(軍)2012-0011。實驗室環(huán)境為溫度(22～26) ℃，濕度44%～65%，光照與黑暗交替出現(xiàn)，光照12 h,黑暗12 h。所有小鼠均給予正常的飲食、飲水飼養(yǎng)，以適應環(huán)境1周。該實驗已通過綿陽市第三人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，均遵守實驗動物管理規(guī)范照料和使用原則。

1.2 試劑與儀器ITRAQ標記試劑盒(美國ABSCIEX公司)；BCA試劑盒(碧云天公司)；蛋白裂解液(美國Bio-Rad公司)。LC-6AD型高效液相色譜儀(日本島津)；TRIPLE TOF5600質(zhì)譜儀配套軟件(美國ABSCIEX公司)；WFZUV-2100型可見紫外分光光度計(尤尼柯)；RVT4104型低溫冷凍干燥器(美國Thermo Fisher)。

2 方法

2.1 動物分組將實驗小鼠按照隨機分組的原則分為正常組和輻射組，每組10只。電離輻照之前，所有小鼠均給予正常的飲食、飲水。

2.2 電離輻照損傷小鼠模型輻射組小鼠常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)1周后，將小鼠放置于自制的紙盒內(nèi)，給予5 Gy60Co γ射線全身輻照小鼠1次，輻照率為1.73 Gy·min-1[11]。輻照完成后，繼續(xù)給予正常組和輻射組小鼠正常的飲食、飲水。

2.3 組織取材輻照完成7 d后，用3.5%的水合氯醛麻醉小鼠，在無菌隔離環(huán)境下解剖小鼠，取出脾臟組織，用0.9%的滅菌生理鹽水反復灌注清洗脾臟組織后，迅速置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.4 脾臟組織蛋白質(zhì)的提取將1 μL蛋白酶抑制劑、5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF加入裂解緩沖液中混合均勻，分裝于2支玻璃勻漿器中并置于冰上預冷。將凍存的小鼠脾臟組織從液氮中取出，每組3只，PBS清洗后，按組別放入玻璃勻漿器中，加適量液氮研磨，再加入預冷的裂解緩沖液，手動充分研磨脾臟組織至均質(zhì)勻漿。冰上超聲破碎脾臟組織，功率80 W，超聲0.8 s，關閉0.8 s，共計3 min。加入5倍體積預冷的丙酮溶液混勻后，靜置于-20 ℃環(huán)境中沉淀4 h，再4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，取沉淀，反復操作，直至沉淀變?yōu)榘咨?80 ℃凍存。

2.5 ITRAQ標記① 蛋白質(zhì)的溶解、定量：取凍存的2組樣品各20 μL，并稀釋至可檢測的濃度范圍。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，調(diào)整蛋白質(zhì)的濃度。② 蛋白還原烷基化及酶切：利用二硫蘇糖打開二硫鍵及碘代乙酰胺烷基化二硫鍵使蛋白質(zhì)充分變性。③ 蛋白標記：平衡ITRAQ試劑至室溫后,離心至管底，并加入150 μL異丙醇溶解。取上述酶解產(chǎn)物50 μL至新的離心管中，加入處理好的ITRAQ試劑，室溫反應2 h，后加入水，讓有機相降低至50%以下以終止反應，混合后、旋渦振蕩、離心后真空冷凍干燥，將兩組蛋白各進行標記，將正常組標記為113，輻射組標記為119。④ SCX分級：將上述標記好的多肽混合物用流動相A(150 μL)經(jīng)復溶、旋渦振蕩處理后，12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液上樣，流速0.8 mL·min-1，按不同的參數(shù)梯度洗脫，據(jù)峰形和時間共收集到50個梯度，冷凍抽干后保存待用。

2.6 質(zhì)譜鑒定各組蛋白質(zhì)樣品用Q-TOF(質(zhì)譜TOF；MS參數(shù)m/z：350～1 500；time：0.25 s)進行iTRAQ標記樣品的質(zhì)譜信息檢測，獲得ITRAQ標記肽段的序列，再根據(jù)肽指紋圖譜鑒定出相應的蛋白質(zhì)。兩ITRAQ離子的峰面積比值可以反映樣品中多肽和蛋白質(zhì)的相對含量。

Fig 1 Differential protein Venn diagram between normal group and ionizing radiation group

A represents proteins identified in the first assay; B represents proteins identified in the second assay. a: Differential proteins between normal group and ionizing radiation group; b: 35 up-regulated differential expressed proteins in the ionizing radiation group compared with the normal group; c: 92 down-regulated differential expressed proteins in the ionizing radiation group compared with the normal group.

2.7 生物信息學鑒定① 采用Perseus1.5.5.3的Significance A方法進行差異蛋白篩選，以P<0.05且FC>1.5或FC<0.667進行差異蛋白篩選。對篩選到共同上調(diào)和共同下調(diào)的差異蛋白，作為最終候選的差異蛋白并進行功能分析。② 利用uniprot數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的分子功能及生物學過程，利用分析軟件DAVID 6.8對差異蛋白進行生物過程、分子功能注釋和細胞成分分析。③ 利用KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對差異蛋白所涉及的通路進行注釋，尋找差異蛋白中顯著性富集的通路(P<0.05)，確定差異蛋白參與最主要的生物學途徑和通路。

3 結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果經(jīng)重慶醫(yī)科大學生命科學院ITRAQ技術平臺進行蛋白質(zhì)組學測定,2次技術重復所鑒定到的差異蛋白質(zhì)維恩分析結(jié)果見Fig 1。本實驗在正常組與輻射組中共鑒定到129個差異蛋白，與正常組比較，輻射組有35個蛋白質(zhì)表達上調(diào)，92個蛋白質(zhì)表達下調(diào)。差異蛋白的網(wǎng)絡分析圖見Fig 2。其中，紅色代表上調(diào)的差異蛋白，綠色代表下調(diào)的差異蛋白，線越粗代表兩蛋白質(zhì)之間的相互作用越強。

3.2 生物學功能分析通過DAVID富集分析系統(tǒng)對實驗獲得的129個差異蛋白進行GO富集分析，研究這些差異蛋白的功能，結(jié)果見Fig 3。BP分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白大多參與翻譯、細胞質(zhì)翻譯、核小體組裝、核小體定位和肌動蛋白絲覆蓋。MF分析得出這些差異蛋白主要與核糖體的結(jié)構(gòu)組成、RNA結(jié)合、染色質(zhì)DNA結(jié)合、rRNA大核糖體亞基結(jié)合有關。CC分析揭示，這些差異蛋白分布在細胞核、核糖體、細胞內(nèi)核糖體蛋白復合體、細胞質(zhì)大核糖體亞基、細胞質(zhì)小核糖體亞基、核糖體亞基上。

Fig 2 Network analysis of differentially expressedproteins in spleen tissues of mice in normalgroup and ionizing radiation group

3.3 KEGG通路注釋結(jié)果將正常組與電離輻射組小鼠的脾臟組織鑒定到的差異蛋白，運用DAVID 6.8分析軟件進行KGEE Pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)有57個差異蛋白，參與了17條生物信號通路(P<0.05),其中有50個差異蛋白表達上調(diào)，7個差異蛋白表達下調(diào)。差異蛋白富集最明顯的10條通路見Fig 4。從圖中發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要富集在核糖體、細胞外基質(zhì)受體的相互作用、蛋白質(zhì)消化與吸收、黏著斑、PI3K-Akt信號通路、阿米巴病、小細胞肺癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥途徑、抗原處理和呈現(xiàn)的信號通路中。

本實驗發(fā)現(xiàn)，富集在核糖體信號通路中的差異蛋白質(zhì)有37個，信號通路圖見Fig 5。有36個差異蛋白質(zhì)表達下調(diào)，分別是60S核糖體蛋白L34(Rpl34)、60S核糖體蛋白L27(Rpl27)、60S核糖體蛋白L21(Rpl21)、60S核糖體蛋白L14(Rpl14)、60S核糖體蛋白L23(Rpl23)、60S核糖體蛋白L6(Rpl6)、60S核糖體蛋白L10(Rpl10)、60S核糖體蛋白L13(Rpl13)、60S核糖體蛋白L7(Rpl7)、60S核糖體蛋白L27a(Rpl27a)、60S核糖體蛋白L8(Rpl8)、60S核糖體蛋白L31(Rpl31)、40S核糖體蛋白S8(Rps8)、40S核糖體蛋白S9(Rps9)、40S核糖體蛋白S4(Rps4x)、40S核糖體蛋白S26(Rps26)、40S核糖體蛋白S3a(Rps3a1)、核糖體蛋白L4(Rpl4)、核糖體蛋白S15A(Rps15a)、核糖體蛋白L15(Rpl15)、核糖體蛋白L19(Rpl19)、核糖體蛋白L28(Rpl28)、核糖體蛋白(Rpl10a)、核糖體蛋白16(Rps16)、MCG10725, 異構(gòu)體CRA a(Rps25)、MCG13615, 異構(gòu)體CRA a(Rpl3)、MCG23000, 異構(gòu)體CRA b(Rps18)、MCG23455, 異構(gòu)體CRA e(Rpl13a)、MCG132477, 異構(gòu)體 CRA a(Rpl18)、無特征性蛋白(Rps2)、無特征性蛋白(Rpl3)、無特征性蛋白(Rps23)、蛋白MCG12304(Rpl22)、蛋白MCG10205(Rps13)、Rpl17蛋白(Rpl17)、Rpl7a蛋白(Rpl7a)，有1個差異蛋白的表達上調(diào)，是MCG10168蛋白(Rplp1)。進一步利用String10.5和Cytoscape 3.6.1制作差異蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，見Fig 6，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白之間是相互聯(lián)系的，且相互作用關系復雜。

Fig3GOfunctionenrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedproteinsinspleentissuesofmiceinnormalgroupandionizingradiationgroup
A: Biological process categories. 1: translation; 2: cytoplasmic translation; 3: nucleosome assembly; 4: porphyrin-containing compound biosynthetic process; 5: protein heterotrimerization; 6: collagen-activated tyrosine kinase receptor signaling pathway; 7: histone H3-K27 trimethylation; 8: nucleosome positioning; 9: histone H3-K4 trimethylation; 10: action filament capping. B: Molecular function categories. 1: structural constituent of ribosome; 2: poly(A) RNA binding; 3: chromatin DNA binding; 4: extracellular matrix structural constituent; 5: RNA binding; 6: 5.8SrRNA binding; 7: mRNA binding; 8: 5SrRNA binding; 9: platelet-derived growth factor binding; 10: large ribosomal subunit rRNA binding. C: Cellular component categories. 1: ribosome; 2: intracellular ribonucleoprotein complex; 3: cytosolic large ribosomal subunit; 4: extracellular matrix; 5: extracellular exosome; 6: focal adhesion; 7: cytosolic small ribosomal subunit; 8: proteinaceous extracellular matrix; 9: nucleolus; 10: small ribosomal subunit.

Fig 4 Distribution of top ten sites in enriched KEGGsignaling pathway of differential expressed proteins in spleentissues of mice in normal group and ionizing radiation group

1: ribosome; 2: EMC-receptor interaction; 3: protein digestion and absorption; 4: focal adhesion; 5: PI3K-Akt signaling pathway; 6: amoebiasis; 7: small cell lung cancer; 8: systemic lupus erythematosus; 9: proximal tubule bicarbonate reclamation; 10: antigen processing and presentation.

Fig 5 Enrichment of differentially expressed proteins in spleen tissues of micein ribosome signaling pathway in normal group and ionizing radiation group

Fig 6 Diagrams of 37 differential protein interactionnetwork in ribosome signaling pathway betweennormal group and ionizing radiation group

4 討論

蛋白質(zhì)是生命活動的承擔者，是構(gòu)成生物體細胞和組織的重要物質(zhì)，生物體的一切生命活動都離不開蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)的生物合成受外界環(huán)境因素的影響，如溫度、pH、離子強度、超聲波、紫外線、X射線、輻射等。已有研究表明，電離輻射可導致小鼠的造血細胞、免疫細胞、生殖細胞凋亡，其機制與細胞周期異常、基因表達異常、蛋白質(zhì)的合成異常有關[12]，此外,電離輻射可致機體分子水平發(fā)生變化，如損傷DNA分子(堿基發(fā)生變化及DNA雙鏈發(fā)生斷裂)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞、酶的分解代謝速度加快等；細胞水平上可致細胞發(fā)生凋亡、染色體發(fā)生突變等[13]，這對目前研究電離輻射對機體的損傷作用機制具有重要的意義。

核糖體是蛋白質(zhì)合成的重要場所，是機體細胞中重要的細胞器。核糖體的主要成分是蛋白質(zhì)和RNA。真核生物的核糖體由60S大亞基和40S小亞基共同構(gòu)成，其中，60S大亞基約有49種蛋白質(zhì)和3種rRNA(28S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA)，40S小亞基約有33種蛋白質(zhì)和1種rRNA(18S rRNA)。在蛋白質(zhì)翻譯前，40S核糖體小亞基與mRNA結(jié)合后，再與60S核糖體大亞基結(jié)合，共同構(gòu)成完整的核糖體，從而發(fā)揮核糖體的正常功能。蛋白質(zhì)生物合成這一過程主要由核糖體蛋白、酶、蛋白質(zhì)因子、tRNA和mRNA等的共同參與。

核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖體最主要的成分，廣泛分布于各種組織中，在核糖體的翻譯過程中發(fā)揮著重要的作用。它促使核糖體RNA的折疊，從而執(zhí)行蛋白質(zhì)的翻譯功能，在蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮重要作用。除此之外，核糖體蛋白還具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、參與核糖體的結(jié)構(gòu)組成、調(diào)控mRNA翻譯、影響細胞分化、增殖和凋亡等作用[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，核糖體信號通路中所涉及的差異蛋白，有7個差異蛋白都屬于核糖體蛋白類，分別是Rpl4、Rps15a、Rpl15、Rpl19、Rpl28、Rpl10a、Rps16，這些差異蛋白共同參與了核糖體的結(jié)構(gòu)組成，在蛋白質(zhì)的翻譯過程中發(fā)揮著重要的作用，其中，Rps15a還參與了細胞周期的正向調(diào)控，Rpl10a與細胞質(zhì)的翻譯有關，Rpl19、Rpl10a還與mRNA結(jié)合有關。在電離輻照小鼠脾臟組織中，這些差異蛋白質(zhì)表達下調(diào)，將影響脾臟組織蛋白質(zhì)的生物合成，從而影響脾臟的正常生理功能。

此外，核糖體信號通路所涉及的差異蛋白中，有12個蛋白屬于60S核糖體大亞基蛋白，分別是Rpl34、Rpl27、Rpl21、Rpl14、Rpl23、Rpl6、Rpl10、Rpl13、Rpl7、Rpl27a、Rpl8、Rpl31。其中，Rpl34、Rpl27、Rpl10、Rpl13、Rpl27a、Rpl31參與了核糖體的結(jié)構(gòu)組成和蛋白質(zhì)的翻譯過程，Rpl27參與蛋白的翻譯及rRNA的翻譯過程，Rpl8參與細胞對神經(jīng)生長因子刺激反應、細胞質(zhì)翻譯過程，Rpl14參與RNA加工和結(jié)合、核糖體大亞基的生物形成，Rpl23參與細胞周期阻滯的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的負調(diào)控、細胞增殖的正向調(diào)控、基因表達的正向調(diào)控、p53類介質(zhì)對信號轉(zhuǎn)導的正向調(diào)控、參與核糖體的結(jié)構(gòu)組成，這些差異蛋白表達下調(diào)，蛋白質(zhì)在核糖體上的翻譯受阻，從而影響脾臟細胞的正常生理功能。

在核糖體信號通路有5個差異蛋白屬于40S核糖體小亞基蛋白，分別是Rps8、Rps9、Rps4x、Rps4x、Rps3a1，這些差異蛋白都參與了核糖體的結(jié)構(gòu)組成及蛋白質(zhì)的翻譯過程。其中，Rps9參與細胞周期的正向調(diào)控、細胞質(zhì)翻譯的正向調(diào)控，Rps3a1還與細胞的分化有關，它們表達下調(diào)影響核糖體的正常功能，影響細胞周期的正常調(diào)控。

在核糖體信號通路中,Rps25、Rpl3、Rps18、Rpl18、Rpl13a、Rpl18、Rps2、Rps23、Rpl22、Rps13、Rpl17、Rpl7a差異蛋白表達下調(diào)，其中Rps18、Rpl13a、Rpl18、Rps2、Rps23、Rpl3、Rpl17、Rpl7a參與了核糖體的結(jié)構(gòu)組成及翻譯過程，在電離輻射中這些差異蛋白表達下調(diào)，影響核糖體的正常功能及蛋白質(zhì)的翻譯過程；Rps25、Rpl3、Rpl22、Rps13、Rplp1在核糖體信號通路中的功能尚不明確，這些差異蛋白會不會影響核糖體的正常功能及蛋白質(zhì)的生物合成，影響小鼠脾臟組織細胞的正常生理功能，值得我們進一步研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在電離輻照小鼠脾臟組織核糖體信號通路中，核糖體蛋白、60S核糖體大亞基蛋白以及40S核糖體小亞基蛋白及其它蛋白在電離輻照后的小鼠脾臟組織中出現(xiàn)低表達，影響了核糖體的正常生理功能，從而影響蛋白質(zhì)的生物合成。表明電離輻照可能導致核糖體的功能異常，使蛋白質(zhì)的合成受阻，繼而影響脾臟細胞的正常生理功能。本實驗研究表明，核糖體對機體蛋白質(zhì)的合成至關重要，通過對核糖體信號通路的研究，將有助于我們深入了解電離輻照后小鼠脾臟組織蛋白質(zhì)合成障礙的機制，為電離輻照損傷尋找新靶點提供參考依據(jù)。

(致謝：感謝中國工程物理研究院核物理與化學研究所對動物造模提供幫助，感謝綿陽市第三人民醫(yī)院病理科的宋大萍老師給予病理技術支持與指導，感謝徐敬文、王小紅、吳思霖在動物實驗中給予支持與幫助。)