張倩韜，侯敏娜，彭修娟，杜 蓓，蔡 潔，劉 峰，3

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院 1. 醫(yī)藥學(xué)院、2. 中藥研究院，陜西 西安 712046；3. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯源于《內(nèi)外傷辨惑論》(金·李東垣)，由君藥黃芪和臣藥當(dāng)歸5 ∶1組成，是益氣養(yǎng)陰名方[1]。糖尿病(diabetes mellitus, DM)屬中醫(yī)“消渴癥”的范疇[2]，主要發(fā)病機制為先天不足、七情失調(diào)、勞欲過度致陰虛燥熱，陰虛易產(chǎn)生內(nèi)熱，熱灼更傷津液，津傷氣血，運行不通，血液在脈管中運行瘀滯。現(xiàn)代研究認(rèn)為，DM是由于胰島素分泌絕對不足或胰島素抵抗引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)代謝紊亂的代謝性疾病群，以高血糖為主要標(biāo)志，隨著病情的遷延，容易出現(xiàn)心腦血管病變、DM腎病、神經(jīng)病變、DM足等并發(fā)癥。大量臨床研究表明，當(dāng)歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的療效明顯[3]，能全面改善該病癥的多個指標(biāo)，延緩并發(fā)癥的發(fā)生，且藥物不良反應(yīng)較少[4]。

“2017中國Ⅱ型糖尿病防治指南”指出，我國成年人Ⅱ型DM的發(fā)病率已高達(dá)10.9%，呈發(fā)病年輕化及逐年上升趨勢，已成為最常見的慢性病之一[5]。中醫(yī)藥治療“消渴癥”已有上千年的歷史，然而，中藥方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以闡明，藥理機制難以說清，服用劑量難以明確，長期應(yīng)用的安全性評價等諸多問題，嚴(yán)重制約了經(jīng)典名方的深入研發(fā)。這就使得中藥防治DM藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)和作用機制的闡明，成為了當(dāng)前亟待解決的問題。中藥整合藥理學(xué)平臺(integrative pharmacology of traditional Chinese medicine, TCMIP)是基于大數(shù)據(jù)和多學(xué)科交叉思維，在方劑、中藥材、中藥成分、疾病/癥狀靶標(biāo)4個數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，構(gòu)建“藥物成分-作用靶標(biāo)-疾病通路”互相作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測中藥及其方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制、藥理效應(yīng)等[6]。本研究借助TCMIP平臺，探討當(dāng)歸補血湯防治DM及其并發(fā)癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，以期為當(dāng)歸補血湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的辨識、制劑質(zhì)量的評價、作用機制的闡明及其在DM的中藥防治中提供有益指導(dǎo)。

1 方法

1.1 當(dāng)歸補血湯的化學(xué)成分來源在TCMIP的“中藥材數(shù)據(jù)庫”中，添加“黃芪”、“當(dāng)歸”，建立當(dāng)歸補血湯的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶標(biāo)來源及其靶標(biāo)預(yù)測在TCMIP的“疾病靶標(biāo)信息設(shè)定”中，以“diabetes”為關(guān)鍵詞，檢索疾病/癥狀的靶標(biāo)，作為DM的已知疾病靶標(biāo)；在“中藥靶標(biāo)預(yù)測”界面中，選取藥物相似性分?jǐn)?shù)≥0.7的化學(xué)成分預(yù)測的靶標(biāo)當(dāng)做候選靶標(biāo)來源，相似性藥物作用的靶標(biāo)即為當(dāng)歸補血湯潛在的作用靶標(biāo)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息TCMIP整合了8個現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)資源，分別為Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database、Reactome、Online Predicted Human Interaction Database、InAct、Human Protein reference Database、Molecular Interaction Database、Database of Interacting Protein和PDZBase。通過TCMIP的PPI數(shù)據(jù)庫，即可獲得當(dāng)歸補血湯作用靶標(biāo)與DM疾病靶標(biāo)之間的PPI信息。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析通過TCMIP的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，針對當(dāng)歸補血湯潛在藥靶與DM靶標(biāo)之間的PPI計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，以“?jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥方劑靶標(biāo)-疾病基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(hubs)；在此基礎(chǔ)上，以“degree”、“節(jié)點緊密度(closeness)”和“節(jié)點介度(betweenness)”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為中藥方劑矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。最后，對關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通路富集，選取P-Value值前30的關(guān)鍵通路，構(gòu)建“中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路-疾病關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從而揭示當(dāng)歸補血湯的作用機制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.5 基因功能和通路富集分析TCMIP鑲嵌了基因本體(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路數(shù)據(jù)庫的資源，對關(guān)鍵靶標(biāo)的基因和通路富集分析，選擇P-Value值前20的關(guān)鍵通路信息列于表中。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補血湯化學(xué)成分及其預(yù)測靶標(biāo)分析基于TCMIP平臺，黃芪收集到29個化學(xué)成分，主要為黃芪皂苷類、黃芪苷類、黃酮類等；當(dāng)歸收集到65個化學(xué)成分，主要為揮發(fā)油類(如藁本內(nèi)酯、正丁烯內(nèi)酯、歸酮、異丁香酚)、有機酸類(阿魏酸)、當(dāng)歸內(nèi)酯類等。黃芪的29個成分預(yù)測出796個藥物靶標(biāo)，當(dāng)歸的65個成分預(yù)測出774個藥物靶標(biāo)。

采用“1.2”的方法，選取藥物相似性分?jǐn)?shù)≥0.7的化學(xué)成分預(yù)測靶標(biāo)，作為當(dāng)歸補血湯潛在的作用靶標(biāo)。當(dāng)歸和黃芪兩藥共有靶標(biāo)分析結(jié)果顯示，黃芪的潛在藥靶有399個，當(dāng)歸的潛在藥靶有396個，且黃芪與當(dāng)歸間共有作用靶標(biāo)高達(dá)208個，說明黃芪和當(dāng)歸間有很強的協(xié)同疊加作用。

2.2 當(dāng)歸補血湯候選靶標(biāo)基因功能及所參與的通路分析對當(dāng)歸補血湯的潛在藥靶進(jìn)行GO分析，所得分析結(jié)果中，選擇P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 1中。Tab 1是當(dāng)歸補血湯候選靶標(biāo)基因所參與的生物學(xué)功能信息。由Tab 1可知，當(dāng)歸補血湯候選靶標(biāo)基因主要參與了機體的氫離子跨膜轉(zhuǎn)運、氧化還原過程、線粒體電子轉(zhuǎn)運、前體代謝物和能量生成、維生素代謝、化學(xué)突觸傳遞等生物學(xué)過程；在細(xì)胞組分方面，主要存在于線粒體、線粒體內(nèi)膜、線粒體基質(zhì)等組分當(dāng)中；在分子功能方面，主要介導(dǎo)了谷氨酸門控離子通道活性、離子型谷氨酸受體信號通路及谷氨酸受體信號通路、天門冬氨酸-谷氨酸受體活性及谷氨酸受體的活性、CYP450酶活性、輔酶Q活性等分子生物學(xué)過程。

Tab 1 The functional information of Danggui Buxue decoction candidate target

同時，對當(dāng)歸補血湯潛在藥靶進(jìn)行KEGG通路富集分析，所得分析結(jié)果中，選擇P-Value值前20的關(guān)鍵通路信息列于Tab 2中。Tab 2是當(dāng)歸補血湯候選靶標(biāo)基因組所參與的生物學(xué)調(diào)控通路信息。由Tab 2可知，當(dāng)歸補血湯候選藥靶主要參與了內(nèi)分泌及代謝疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、心肌收縮、非酒精性脂肪肝、帕金森病、神經(jīng)退行性疾病、藥物上癮等疾病過程，以及谷氨酸能神經(jīng)突觸、輔酶和維生素的代謝、能量代謝、氧化磷酸化、葉酸的一碳單位、氨基酸代謝等代謝途徑。

Tab 2 The pathway information of Danggui Buxue decoction candidate target

2.3 當(dāng)歸補血湯防治糖尿病的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

2.3.1當(dāng)歸補血湯防治DM的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò) 通過TCMIP的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，采用“1.3”和“1.4”所示方法，建立當(dāng)歸補血湯藥靶與DM靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選得到202個關(guān)鍵靶標(biāo)，其中藥物直接作用靶標(biāo)86個，已知的疾病靶標(biāo)10個，疾病與藥物間的共有靶標(biāo)3個，其他間接靶標(biāo)101個。根據(jù)Degree值僅顯示前100個靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)，紅色代表藥物直接作用靶標(biāo)，黃色代表已知的疾病靶標(biāo)，綠色代表藥物與疾病間共有靶標(biāo)，見Fig 1，圖中節(jié)點大小與Degree值成正比。

藥物作用靶點的主要來源是疾病靶點，由Fig 1可知，當(dāng)歸補血湯與DM間的共有靶標(biāo)有3個，分別為精氨酸加壓素受體(arginine vasopressin receptor，AVPR)的3個亞型：AVPR1A、AVPR1B和AVPR2。AVPR在體內(nèi)分布廣泛，與機體的血壓調(diào)節(jié)、心臟活動，血糖代謝、血栓形成、腎臟的水鹽代謝、炎癥反應(yīng)和大腦學(xué)習(xí)記憶等過程密切相關(guān)[7]。有研究表明，AVPR基因缺陷，是導(dǎo)致腎性糖尿病(以煩渴、多飲、多尿及低比重尿為主要臨床表現(xiàn))的重要原因[8]，推測當(dāng)歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的防治作用可能與AVPR介導(dǎo)的心血管-腎臟系統(tǒng)作用有關(guān)。

Fig 1 Network of Danggui Buxue decoction candidate targets for diabetes

Red: Putative drug target; Yellow: Known disease target; Green: Common target; Gray: Others.

中藥方劑可通過保護(hù)胰島β細(xì)胞、調(diào)節(jié)血糖血脂代謝異常、改善胰島素抵抗、抑制炎癥反應(yīng)[9]與氧化應(yīng)激[10]等環(huán)節(jié)，來發(fā)揮防治DM的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補血湯能降低血糖，明顯改善DM的“三多一少”癥狀[11]，及其心血管系統(tǒng)[12]、腎臟、周圍神經(jīng)病變、眼睛病變等并發(fā)癥。張瑩雯等[13]研究表明，當(dāng)歸補血湯可抑制腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)mRNA的表達(dá)，改善腎功能，延緩DM腎病病理進(jìn)展；周肖等[14]運用當(dāng)歸補血方加減對氣虛血瘀型糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)患者進(jìn)行為期4周的三陰交、涌泉敷貼治療，結(jié)果表明，當(dāng)歸補血方穴位敷貼能夠改善氣虛血瘀型DPN患者肢體疼痛、肢體麻木、手足畏寒、倦怠乏力等不適癥狀，并改善氣虛血瘀型DPN患者的感覺功能。郭藝娟等[15]研究表明，當(dāng)歸補血湯加味通過降低DM大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的滲漏，對DM視網(wǎng)膜早期病變有防治作用，其作用機制可能是抑制NF-κB的激活。

2.3.2當(dāng)歸補血湯防治DM的GO基因功能及KEGG通路富集分析 基于TCMIP的疾病靶標(biāo)信息，采用“1.5”的方法，對DM靶標(biāo)進(jìn)行GO分析，選擇P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 3中。Tab 3是DM靶標(biāo)基因所參與的生物學(xué)功能信息。由Tab 3可知，參與DM病理過程的基因主要分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體及線粒體內(nèi)膜等細(xì)胞器，通過調(diào)控機體細(xì)胞的凋亡和增殖，參與了ATP結(jié)合、蛋白激酶活化、腺苷酸環(huán)化酶激活、蛋白質(zhì)磷酸化、氨基酸磷酸化、血小板激活、脂肪酸β氧化、線粒體電子轉(zhuǎn)運、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，把細(xì)胞外的信號傳入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。

Tab 3 The target functional information of Danggui Buxue decoction on diabetes

基于TCMIP的疾病靶標(biāo)信息，采用“1.5”的方法，對DM靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析，選擇P-Value值前20的關(guān)鍵通路信息列于Tab 4中。Tab 4是DM靶標(biāo)基因組所參與的生物學(xué)調(diào)控通路信息。由Tab 4可知，參與DM病理過程的通路主要集中在內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞間隙連接、激素信號通路、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、長期的抑郁，長期應(yīng)激狀態(tài)、谷氨酸能突觸、晝夜節(jié)律等多條信號通路，以及神經(jīng)退行性疾病、前列腺癌、乙型肝炎、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、阿爾茨海默病、亨廷頓病等疾病相關(guān)通路。中醫(yī)將DM劃分為脾癉和消癉兩種類型，全程分為郁、熱、虛、損4個階段。郁階段多見于DM前期，熱階段多見于DM早期，虛階段多見于DM中期，損階段多見于DM晚期。當(dāng)歸補血湯可根據(jù)消渴癥不同階段的核心病機進(jìn)行分型論治，從而達(dá)到多途徑、多層次、多靶點、多環(huán)節(jié)干預(yù)DM及其并發(fā)癥的作用。

Tab 4 The target pathway information of Danggui Buxue decoction on the diabetes

2.4 當(dāng)歸補血湯防治糖尿病的“中藥-核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析基于Fig 1當(dāng)歸補血湯藥靶與DM疾病靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)信息，采用“1.3”和“1.4”的方法，構(gòu)建了當(dāng)歸補血湯防治DM的“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見Fig 2(綠色表示中藥材，紫色表示化學(xué)成分，藍(lán)色表示藥物靶標(biāo)，紅色表示疾病通路)。由Fig 2可知，當(dāng)歸補血湯的50個核心“黃芪-當(dāng)歸”化學(xué)成分，通過直接或間接作用于60個關(guān)鍵藥靶，這些藥靶作用于神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞間連接、激素信號通路、心血管循環(huán)系統(tǒng)等30條主要調(diào)控通路，來糾正DM及其并發(fā)癥的疾病失衡網(wǎng)絡(luò)。黃芪的29個化學(xué)成分中有22個參與了DM的防治，主要為三萜環(huán)黃氏醇、熊竹素、乙酰黃芪苷I、黃芪皂苷I～黃芪皂苷Ⅷ、膜莢黃芪苷Ⅰ、膜莢黃芪苷Ⅱ、異黃芪苷Ⅰ、異黃芪苷Ⅱ、綿毛黃芪皂苷Ⅸ等；當(dāng)歸的65個化學(xué)成分中有28個參與了DM的防治，主要為阿魏酸、茴香酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、琥珀酸、癸二酸、壬二酸、二十四烷酸等有機酸，β-甜沒藥烯、甲基苯酚、乙基苯酚、二羥基苯乙酮、香草醛等油性成分，豆甾醇-β-D-葡萄糖苷、傘形花內(nèi)酯、東莨菪素等?？梢婞S芪為該方中發(fā)揮防治DM作用的核心中藥，也體現(xiàn)了當(dāng)歸補血湯方重用黃芪的科學(xué)性和合理性。

Fig 2 The “compound-target-pathway” network of Danggui Buxue decoction

Green: Traditional Chinese medicine; Purple: Compound; Blue: Target; Red: Pathway.

3 討論

本研究采用整合藥理學(xué)方法，對經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯防治DM的作用機制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了預(yù)測分析。預(yù)測過程中收集了方劑-病癥的化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、基因組學(xué)數(shù)據(jù)、蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)及PPI交互網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)等，以便更合理的研究開發(fā)經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯。

TCMIP預(yù)測結(jié)果表明，主要有50個“黃芪-當(dāng)歸”化學(xué)成分，通過直接或間接作用相關(guān)靶標(biāo)和通路，來糾正DM及其并發(fā)癥的疾病失衡網(wǎng)絡(luò)。在G0基因功能信息方面，預(yù)測結(jié)果表明，當(dāng)歸補血湯通過直接或間接作用于線粒體、線粒體內(nèi)膜及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)等細(xì)胞器，通過介導(dǎo)多種離子通道活性、酶活性及受體信號通路，影響跨膜轉(zhuǎn)運作用，在物質(zhì)轉(zhuǎn)運、電子轉(zhuǎn)運、物質(zhì)代謝和能量代謝過程中起作用。在KEGG調(diào)控通路方面，預(yù)測結(jié)果表明，當(dāng)歸補血湯主要參與了DM的谷氨酸能突觸傳遞、氧化磷酸化、輔酶和維生素的代謝、能量代謝，氨基酸代謝等代謝途徑，以及內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞間隙連接、激素信號通路、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、長期應(yīng)激狀態(tài)等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也參與了DM引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病、非酒精性脂肪肝和心肌收縮等并發(fā)癥。

在GO基因功能信息和KEGG調(diào)控通路的基礎(chǔ)上，通過TCMIP的PPI數(shù)據(jù)資源，篩選到疾病與藥物間的共有靶標(biāo)為AVPR1A、AVPR1B和AVPR2，該受體在體內(nèi)分布廣泛，參與了機體的血壓調(diào)節(jié)、心臟活動，血糖代謝、血栓形成、腎臟的水鹽代謝、炎癥反應(yīng)和大腦的學(xué)習(xí)記憶等眾多生命活動。推測當(dāng)歸補血湯對DM及其并發(fā)癥的作用機制可能是通過AVPR受體信號通路來發(fā)揮的。本研究是基于TCMIP所做的預(yù)測分析，當(dāng)歸補血湯防治DM的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制還需通過實驗研究加以驗證。望本研究能夠為經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯的深入研究開發(fā)及中藥方劑對DM及其并發(fā)癥的防治提供一些新思路，進(jìn)而為DM的中藥防治提供更多的臨床選擇。

(致謝：本研究是在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供的中藥整合藥理學(xué)平臺完成的，感謝該研究所的許海玉博士在研究過程中給予的指導(dǎo)和幫助。)