孟劉坤，滕 曉，袁 雯，孟 健，李 君，劉曉艷

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心阜外醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037；2. 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學研究中心，北京 100020)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種由異源性疾病以不同發(fā)病機制引起的，以肺小動脈進行性重構(gòu)和肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床綜合征[1]，具有潛在致死性，是繼冠脈綜合征、高血壓之后最常見的心血管病綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈細胞組份重獲增殖潛能導致的肺血管持續(xù)性重構(gòu)是PAH的主要病理改變，表現(xiàn)為無肌層肺小動脈肌化，肌性肺動脈中膜肌層增厚，特征性的肺小動脈新生內(nèi)膜和叢狀病變的形成[2]。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細胞瘤抑瘤蛋白1(neuroblastoma suppression of tumorigenicity 1，NBL1)在正常肺組織中表達水平最高，而其在肺組織發(fā)育及病理狀態(tài)下的作用至今未知[3-5]。腫瘤方面的研究發(fā)現(xiàn)，NBL1對腫瘤細胞的增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-9]，但NBL1對肺動脈細胞的影響至今未知。因此，我們推測NBL1或參與了PAH的肺血管重構(gòu)。本實驗擬研究野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的PAH大鼠肺組織和血漿中NBL1的水平及變化趨勢，為探討其在肺血管重構(gòu)中的作用及作為PAH潛在的生物標志物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量(200±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，均在中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2試劑 MCT (Sigma公司)；TRIzol (Invitrogen公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物(TaKaRa生物工程有限公司)；抗NBL1抗體(Proteintech公司)；抗p-Smad1/5/8抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗Smad1/5/8抗體(Santa Cruz公司)；抗GAPDH抗體(Abmart公司)；二辛可酸蛋白定量試劑盒(Abcam公司, ab102536)；NBL1 ELISA檢測試劑盒(R&D公司, DY955)；Power SYBR green PCR mastermix (ABI公司)；重組人BMP-2、重組人BMP-4(R&D公司)。

1.1.3儀器 Inspria ASVP小動物呼吸機(Harvard Apparatus公司)；Powerlab 16/30生理記錄儀(AD Instruments公司)； 奧德賽紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences)。

1.2 動物實驗

1.2.1MCT誘導的PAH動物模型的制備 大鼠隨機分為對照組(Control組)、野百合堿3周組(MCT-3W)、野百合堿4周組(MCT-4W)、野百合堿5周組(MCT-5W)，每組10只。分別腹腔注射無菌生理鹽水或MCT 60 mg·kg-1。腹腔注射后，SD大鼠置于恒溫室內(nèi)飼養(yǎng)(21 ℃，相對濕度50%～70%)，不限食水。本研究相關(guān)動物實驗得到北京協(xié)和醫(yī)學院阜外醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準(北京協(xié)和醫(yī)學院阜外醫(yī)院動物委員會，NO. 0000502)。

1.2.2肺血流動力學指標的測量 MCT組注射MCT后3～5周，以及Control組注射生理鹽水后5周，行右心導管測量肺血流動力學指標[10-11]。將13 cm長、尖端彎曲的聚乙烯右心導管(外徑0.9 mm，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)所病理生理學實驗室提供)用肝素生理鹽水預充后，一端連于Powerlab 16/30，一端緩慢送入右側(cè)頸外靜脈、右心房、右心室和肺動脈主干，記錄肺循環(huán)血流動力學指標(右心室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)，右心導管的具體位置以上述部位的典型壓力波形和波幅來確定。

1.2.3大鼠血漿NBL1濃度的測定 右心導管測壓完成后，用采血針經(jīng)下腔靜脈采血2 mL, EDTA抗凝，4 ℃靜置0.5 h后，3 000 r·min-1離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。大鼠血漿NBL1濃度的測定分別使用雙抗體夾心法ELISA試劑盒，檢測范圍分別為62.5～4 000 ng·L-1。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.4心肺組織取材及右室肥厚指數(shù)的計算 肺血流動力學測量后，以4 ℃ PBS經(jīng)下腔靜脈快速沖洗心肺組織，沖洗完畢后，迅速整體剪下心肺組織置于冰塊上；剪下左肺上部，存放于凍存管后，迅速放于-80 ℃液氮中保存，以備后續(xù)qPCR和Western blot檢測NBL1表達水平的變化；余肺置于10%中性福爾馬林常溫固定24 h，流水沖洗12 h，制成肺組織蠟塊，用于免疫組織化學檢測NBL1的肺組織定位。

取出心臟，生理鹽水沖凈，去除左右心房及相連大血管, 將右心室(right ventricular, RV)、左心室(left ventricular, LV)及室間隔(interventricular septum，IVS)剪下，濾紙吸干后稱重。按如下公式計算右室肥厚指數(shù)(fulton index): Fulton index=RV/(LV+IVS)。

1.3 體外細胞功能學實驗人肺動脈內(nèi)皮細胞購于ScienCell公司，將液氮中凍存的肺動脈內(nèi)皮細胞進行復蘇及傳代，置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中，以完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將2～3代的肺動脈內(nèi)皮細胞以2×105個細胞接種于25 cm2塑料細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至融合率達到80%～90%后，進行后續(xù)的細胞功能學實驗。分為4組：對照組、BMP-2/4(20 μg·L-1)刺激組、NBL1(100、2 000 μg·L-1)+BMP-2/4(20 μg·L-1)組。

1.4 實時熒光定量PCR檢測TRIzol法提取肺組織總RNA，取純化的RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR方法檢測NBL1 mRNA的表達變化[12]。各引物序列如下: NBL1正向引物5′-CCACAGGATGCCTGAAGATGAA-3′, 反向引物5′-AGGTTAGCCTGGGCAGGATTG-3′; GAPDH正向引物5′-GGCACAGTCAAGGCGAGAATG -3′, 反向引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 Western blot實驗提取制備肺組織或肺動脈內(nèi)皮細胞總蛋白樣品，二辛可酸法測定蛋白樣品濃度后，各肺組織標本取50 μg蛋白，100 ℃加熱5 min蛋白變性，然后4%～12%的Nu-PAGE預制膠上行電泳分離蛋白質(zhì); 經(jīng)半干轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶常溫下封閉1 h，一抗 (抗NBL 1 ∶500，抗GAPDH 1 ∶5 000) 4 ℃搖床孵育過夜; 洗膜緩沖液漂洗后，加入IRDye 680二抗 (1 ∶1 000)，室溫下反應1 h后，TBST再次洗滌，使用奧德賽紅外成像系統(tǒng)進行成像。

1.6 免疫組織化學染色取肺組織蠟塊，切片(2～4 μm)，貼片, 二甲苯透明及無水乙醇梯度脫水，PBS洗滌，5 min×3次，100 ℃沸水中高壓修復抗原; 滴加Triton X-100(體積分數(shù)0.3%)破細胞膜，并孵育20 min; 山羊血清封閉非特異性位點20 min后，滴加抗NBL1一抗 (1 ∶400)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫45 min, PBS洗滌，5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記二抗 (1 ∶400)，37 ℃孵育1 h; PBS洗滌，5 min×3次，DAB顯色液顯色5～10 min，顯微鏡下掌握好顯色程度，流水沖洗10 min終止顯色; 蘇木精復染2 min；1%鹽酸乙醇分化20 s；流水沖洗10 min；乙醇梯度脫水；二甲苯透明；封片，鏡檢拍片(顯棕褐色者為陽性)。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物總體存活情況與PAH模型程度的評估注射操作未引發(fā)相關(guān)死亡。Control組飼養(yǎng)過程中無死亡；MCT-3W組死亡1只，MCT-4W組死亡3只，MCT-5W組死亡4只，尸檢發(fā)現(xiàn)胸腔積液，肝臟淤血硬化，死亡原因考慮為心力衰竭，剩余的實驗動物全部存活至取材時間，右心導管測壓過程無操作相關(guān)死亡，相應數(shù)據(jù)全部包括在最后的數(shù)據(jù)分析中。

腹腔注射MCT 3周～5周期間，MCT組的肺血流動力學指標(右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)和右心室肥厚程度均較對照組大鼠明顯升高，且這種升高表現(xiàn)為時間依賴的漸進性升高(Tab 1)。提示MCT在SD大鼠上成功誘導出典型的PAH疾病狀態(tài)，能很好地模擬PAH的病理生理學狀態(tài)。

2.2 NBL1 mRNA在PAH大鼠肺組織中的表達變化如Fig 1所示，與對照組相比，MCT誘導的PAH大鼠肺組織NBL1 mRNA水平呈時間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1 mRNA水平開始明顯降低，3周、4周、5周時較對照組分別下降70%、81%和89%。

Tab 1 Hemodynamic indices and right ventricular hypertrophy index of rats

RVSP: right ventricular systolic pressure value; PASP: pulmonary artery systolic pressure value; mPAP: mean pulmonary artery pressure value; Fulton index: right ventricular hypertrophy index.**P<0.01vscontrol.

Fig 1 Changes of NBL1 mRNA levels in MCT induced PAH rat lungs

##P<0.01vscontrol group.

2.3 NBL1蛋白在PAH大鼠肺組織中的表達變化如Fig 2所示，與對照組相比，MCT誘導的PAH大鼠肺組織NBL1的蛋白水平呈時間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1蛋白水平較對照組開始降低，5周時幾乎檢測不到。

Fig 2 Expression trend of protein level of NBL1 in rat lungs with MCT-induced PAH

##P<0.01vscontrol group

2.4 NBL1在MCT誘導的PAH肺組織中的變化趨勢免疫組織化學染色顯示(Fig 3)，NBL1在正常肺組織肺小動脈管壁中強表達，但在MCT誘導的PAH大鼠肺組織中，中膜肥厚的肺小動脈管壁中僅檢測到微弱的NBL1表達。

Fig 3 Localization of NBL1 protein in pulmonary arterioles (×1000)

A: Normal pulmonary artery in lungs from control group; B: Pulmonary artery with mild thickened media in lungs from MCT-5 weeks group; C: Pulmonary artery with severe thickened media in lungs from MCT-5 weeks group.

2.5 NBL1血漿濃度在PAH大鼠中的變化趨勢Fig 4的ELISA結(jié)果顯示，MCT誘導的PAH大鼠NBL1血漿濃度較對照組呈現(xiàn)出時間依賴性的明顯降低。Fig 5的相關(guān)性分析顯示，大鼠血漿NBL1濃度與右心導管測定的右心室收縮壓(r=-0.762 2，P<0.01)、肺動脈收縮壓(r=-0.767 1，P<0.01)、平均肺動脈壓(r=-0.789 6，P<0.01)及右室肥厚指數(shù)(r=-0.812 9，P<0.01)均呈明顯負相關(guān)。

Fig 4 Change trend of plasma concentration of NBL1 in rats

##P<0.01vscontrol group

2.6 NBL1抑制BMP2/4誘導的肺動脈內(nèi)皮細胞Smad 1/5/8信號通路的激活為了明確NBL1在PAH發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，我們進行了細胞水平的研究。與預期一致，BMP2/4能誘導肺動脈內(nèi)皮細胞Smad 1/5/8的磷酸化，提示肺動脈內(nèi)皮細胞BMP信號通路的激活；而NBL1則濃度依賴性地抑制BMP2/4引起的肺動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)Smad 1/5/8的磷酸化，提示NBL1能抑制BMP信號通路的激活。見Fig 6。

Fig 5 NBL1 plasma concentration presented a negative correlation with extent of PAH in rats with MCT-induced PAH

3 討論

PAH是炎癥、低氧、體-肺分流、基因突變等原因引起的，以肺血管嚴重重構(gòu)導致肺血管阻力增高為特征的慢性致死性疾病[1]。研究已發(fā)現(xiàn)眾多導致PAH的分子機制，信號通路靶向藥物也已用于臨床治療，PAH患者的癥狀雖有改善，但患者的病死率并未明顯改善[2]，說明PAH研究領(lǐng)域中尚有未被闡明的發(fā)病機制。

NBL1是一種普遍存在于哺乳動物組織和體液中的分泌型蛋白質(zhì)，起初在大鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化模型中發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤作用[3]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，NBL1的表達水平在一些表型轉(zhuǎn)換的細胞中明顯下調(diào)，而NBL1的過表達則抑制靜止細胞進入細胞周期的S期[4,9]。因此，NBL1或是細胞增殖的負調(diào)節(jié)因子，其下調(diào)或缺失或可導致細胞表型的轉(zhuǎn)換。而肺動脈細胞組份表型的轉(zhuǎn)換，即從靜止的、非可遷移的分化表型轉(zhuǎn)化為增殖、可遷移的合成或分泌表型，是PAH進展的主要特點[13]。因此，我們推測NBL1在PAH肺組織和血漿中的變化，可能參與了PAH的發(fā)生和發(fā)展。

目前，PAH研究中多采用MCT誘導的大鼠PAH模型，此模型制備簡單，進展迅速，且個體間PAH程度較均一。另外，在此模型上，先前的研究發(fā)現(xiàn)了PAH的諸多發(fā)病機制，因此，MCT誘導的PAH大鼠模型是可靠的PAH動物模型[11, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射MCT 3周后，SD大鼠肺血流動力學指標(右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)及右室肥厚指數(shù)均呈現(xiàn)時間依賴性的明顯升高，證明MCT誘導的PAH模型制備成功。在此基礎(chǔ)上，我們研究了NBL1水平在MCT誘導的PAH肺組織和血漿中的變化趨勢及其臨床意義。

Fig 6 NBL1 inhibited activation of BMP signal of pulmonary artery endothelial cells induced by BMP2/4 n=3)

A: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-2 induced Smad 1/5/8 phosphoralation; B: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-4 induced Smad 1/5/8 phosphoralation.##P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsBMP4 group.

先前的研究發(fā)現(xiàn)，除肝臟外，NBL1在多種組織器官中均有表達，當然表達的水平不盡相同，其中肺組織的表達最高[3-5]，提示其在肺組織中存在特異性表達的可能，但NBL1在肺組織發(fā)育及病理狀態(tài)下的作用至今沒有研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT誘導PAH大鼠肺組織NBL1的mRNA水平和蛋白水平呈現(xiàn)時間依賴性的逐步降低，且在正常肺組織中，NBL1在肺小動脈管壁中高表達，而在重構(gòu)的肺小動脈中幾乎檢測不到NBL1的表達。BMP受體Ⅱ的致病性突變及BMP信號通路活性的下降，在PAH的進程中發(fā)揮重要作用[15-16]。我們的結(jié)果表明，在肺動脈內(nèi)皮細胞中，NBL1可以拮抗BMP-2和BMP-4刺激Smad 1/5/8磷酸化的作用，提示NBL1可拮抗肺動脈內(nèi)皮細胞中BMP信號通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT注射后，肺組織NBL1表達水平逐步降低，理論上講，會減弱其對BMP信號通路的抑制作用，有拮抗炎癥性PAH進展的潛在作用。目前，臨床工作中常用心臟超聲、右心導管及肺活檢來評價PAH程度，近來生物標志物在PAH領(lǐng)域的研究結(jié)果令人鼓舞，有望在PAH的臨床篩選、診斷、預后評估及隨訪等方面發(fā)揮重要作用[15]。因此，尋找PAH的生物標志物，協(xié)助準確界定PAH程度，可為PAH的臨床干預提供可靠的理論依據(jù)。本研究的ELISA結(jié)果表明，MCT誘導的PAH大鼠模型中，NBL1的血漿濃度亦隨MCT注射后時間的延長而逐漸降低，且與肺血流動力學指標和右室肥厚指數(shù)均呈明顯負相關(guān)，提示NBL1血漿濃度可反映PAH嚴重程度，但PAH病人NBL1血漿濃度的變化尚無研究報道。因此，NBL1作為PAH臨床生物標記物的可行性尚需進一步的臨床驗證。

總之，本實驗證實在MCT誘導的PAH大鼠的肺組織及血漿中，NBL1的水平隨著PAH的發(fā)生、發(fā)展而逐漸降低, 與PAH嚴重程度呈明顯的相關(guān)性, 說明NBL1血漿水平或是PAH潛在的生物標志物。