吳紫君，楊超燕，張錦紅，古熾明，唐春萍，江 煒，鄒國(guó)發(fā)，黃 娟，陳艷芬,4

(1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，2. 廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3. 廣東省中醫(yī)院外二科， 4. 廣州市新藥篩選模型體系構(gòu)建與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

皮膚癬菌感染在人群中發(fā)病率高，近年來(lái)，由于廣泛應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑以及放療、化療等原因，發(fā)病率更呈不斷上升趨勢(shì)。紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)是臨床引起皮膚癬菌病最常見的真菌之一，其所致癬菌病病程長(zhǎng)、難治愈、易復(fù)發(fā)[1-2]，世界各地均有散在的致病報(bào)道，但主要集中在北非和東南亞。隨著真菌感染率的不斷升高和現(xiàn)有抗真菌藥物耐藥性的日趨嚴(yán)重，臨床上對(duì)高效低毒的新型抗真菌藥物的需求日益迫切，而穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是新藥研發(fā)中必不可少的條件。我們近年研究發(fā)現(xiàn)，紅色毛癬菌皮膚感染動(dòng)物模型造模方法不一致，成功率低，而且缺乏模型的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，各種造模方法相互之間可比性較差[3-8]。因此，急需建立一個(gè)科學(xué)的、量化的真菌感染動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。

層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)是一種實(shí)用的多準(zhǔn)則決策法，適合用于評(píng)價(jià)目標(biāo)值難于定量描述、指標(biāo)分層交錯(cuò)的目標(biāo)系統(tǒng)的決策問題，它把定性分析與定量分析有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，把多目標(biāo)、多準(zhǔn)則、難定量的決策問題轉(zhuǎn)化為多層次、單目標(biāo)、可量化的問題，最后通過簡(jiǎn)單的計(jì)算，獲得簡(jiǎn)明的結(jié)果[9]。本研究首先采用AHP建立紅色毛癬菌皮膚感染動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，再以此體系綜合考察評(píng)價(jià)一種動(dòng)物模型需要考慮的多方面特征，包括科學(xué)性、可靠性、重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)性、易操作性等，由此優(yōu)選出理想的動(dòng)物模型，為真菌皮膚感染機(jī)制研究及抗真菌感染新藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)T1d，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(南京)；曲安奈德注射液(昆明積大制藥股份有限公司，批號(hào)：170616)；地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：51705222)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)(海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171128)；豚鼠免疫球蛋白M(IgM)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)：Mar 2018)；屈臣氏絲滑柔和脫毛膏(廣州市花安堂生物科技有限公司，批號(hào)：G0405G1)。

1.2 儀器SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SW-CJ-1F電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)；H1850R醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biotek Instruments)；QC5130電推剪(Lassie’s Trading Company Ltd)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)Hartley豚鼠，體質(zhì)量(220～300) g，♀♂各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2014-0035，動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 建立綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系按照AHP的基本原理和建模步驟[9]，首先通過文獻(xiàn)調(diào)研和專家咨詢，搜集紅色毛癬菌感染豚鼠模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)并設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)指標(biāo)調(diào)查表，考察各個(gè)指標(biāo)的科學(xué)性、必要性和重要性，確立紅色毛癬菌感染豚鼠模型的樹狀指標(biāo)體系。采用德爾菲法，邀請(qǐng)5位專家對(duì)樹狀指標(biāo)體系各層各指標(biāo)相對(duì)重要性進(jìn)行評(píng)分，建立判斷矩陣，采用和積法計(jì)算出各指標(biāo)權(quán)重并檢驗(yàn)矩陣一致性，綜合專家們的評(píng)分得出平均指標(biāo)權(quán)重；進(jìn)一步根據(jù)專家對(duì)各個(gè)詳細(xì)指標(biāo)評(píng)分項(xiàng)的評(píng)價(jià)，匯總得出模型評(píng)價(jià)指標(biāo)賦分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合指標(biāo)權(quán)重和賦分準(zhǔn)則，最終建立紅色毛癬菌感染豚鼠模型的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系。

2.2 構(gòu)建動(dòng)物模型

2.2.1制備菌懸液 參考實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)，將紅色毛癬菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)培養(yǎng)14 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用接種環(huán)輕輕刮取表面菌落移至研磨器，加入適量無(wú)菌生理鹽水，研磨成均勻的混懸液后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用生理鹽水調(diào)整濃度至1×1011cfu·L-1備用。

2.2.2動(dòng)物分組造模 普通級(jí)Hartley豚鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組，每組12只，♀♂各半。1組空白對(duì)照組：不給予任何特殊處理，接種或注射時(shí)給予等體積的生理鹽水；2組：接菌前后注射生理鹽水，背部皮膚接種上述菌懸液1 d(400 μL)[3,8]，d 2接種等體積的生理鹽水；3組：接菌前后注射生理鹽水，背部皮膚接種上述菌懸液2 d(200 μL·d-1)；4組：接菌前注射曲安奈德(20 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌1 d(400 μL)，d 2接種等體積的生理鹽水，接菌后隔天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，共4次[4,6]；5組：接菌前注射曲安奈德(20 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌2 d(200 μL·d-1)，接菌后隔天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，共4次；6組：接菌前注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌1 d(400 μL)，d 2接種等體積的生理鹽水，接菌后每天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)4 d；7組：接菌前注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌2 d(200 μL·d-1)，接菌后每天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)4 d。其中，曲安奈德注射液為肌肉注射，地塞米松磷酸鈉注射液為腹腔注射。見Tab 1。

Tab 1 Animal grouping

豚鼠按分組預(yù)處理，接菌前24 h用電推剪剃去豚鼠背部毛發(fā)，再用脫毛膏清除毛根得到裸露光滑的背部皮膚。接菌前，脫毛部位用酒精消毒，待酒精揮干后，用無(wú)菌粗砂紙磨損皮膚至點(diǎn)狀滲血，在3 cm×3 cm的破損皮膚上均勻涂抹菌懸液，待菌液完全吸收后放回鼠籠，分組處理。接菌后，每天觀察和記錄各組的體征和實(shí)驗(yàn)區(qū)域皮膚的紅斑、鱗屑和毛發(fā)的外觀變化，d 4開始，隔天拔取豚鼠少量毛發(fā)或皮屑，10% KOH直接鏡檢以檢查真菌陽(yáng)性率。結(jié)束免疫抑制劑處理后，豚鼠眼眶前眥采血，采用ELISA法測(cè)定血清中IgM含量。d 14拔取豚鼠的毛發(fā)和鱗屑，接種于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行逆培養(yǎng)，以檢查真菌陽(yáng)性率。根據(jù)各組的病程發(fā)展，各組在病程的前期、中期和后期隨機(jī)挑選2～3只，取其病變部位皮膚進(jìn)行PAS染色和HE染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，解剖取脾臟與胸腺，稱量并計(jì)算其臟器指數(shù)。以上評(píng)價(jià)指標(biāo)按照模型評(píng)價(jià)指標(biāo)賦分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，按權(quán)重計(jì)算出綜合得分。

3 結(jié)果

3.1 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系綜合文獻(xiàn)調(diào)研和專家評(píng)分，按照AHP建立了評(píng)價(jià)目標(biāo)樹(Fig 1)，通過計(jì)算獲得各指標(biāo)權(quán)重(Tab 2)。

Tab 2 Evaluation index weight of guinea pigskininfection model of Trichophyton rubrum

3.2 體征變化各組豚鼠體質(zhì)量均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯差異；免疫抑制劑處理前后與接菌前后，豚鼠進(jìn)食量無(wú)明顯變化，活動(dòng)狀況及精神狀態(tài)均正常。

3.3 外觀變化各組豚鼠約d 7結(jié)痂脫落，1組空白組毛發(fā)正常生長(zhǎng)，無(wú)異常；其余實(shí)驗(yàn)組約d 9開始出現(xiàn)紅斑和鱗屑，d 14左右病情發(fā)展到高峰；2組外觀癥狀輕，約d 21基本恢復(fù)正常；3、4組外觀癥狀稍重，約d 28基本恢復(fù)正常；5～7組外觀癥狀明顯，5組約d 40基本恢復(fù)正常，6、7組d 35基本恢復(fù)正常。病程初期紅斑較鱗屑早出現(xiàn)，鱗屑薄且透明、易脫落；隨后鱗屑逐漸變厚、變黃、難脫落；自愈過程中，紅斑逐漸褪去，鱗屑慢慢脫落，紅斑較鱗屑早褪去，皮膚逐漸變光滑，毛發(fā)受限生長(zhǎng)區(qū)域縮小。見Fig 2。

3.4 病理學(xué)觀察如Fig 3所示，PAS染色顯微鏡下可觀察到菌絲和孢子被染成紫紅色，1組豚鼠皮膚實(shí)驗(yàn)全過程均未見真菌侵染，2組實(shí)驗(yàn)中期、3組各時(shí)期角質(zhì)層可見少量菌絲，4～7組各時(shí)期角質(zhì)層均可見大量菌絲，5～7組隨著病情發(fā)展真菌逐漸侵染到毛囊毛根部。

Fig 4的HE染色顯示，1組豚鼠皮膚實(shí)驗(yàn)前期受到磨損，有少量炎癥細(xì)胞散在真皮淺層，其余各時(shí)期未見炎癥細(xì)胞聚集，2～7組各時(shí)期均有少量炎癥細(xì)胞散布在真皮淺層，3組后期角質(zhì)層有少量炎癥細(xì)胞，4組中期表皮下層有大量炎癥細(xì)胞聚集，5、6、7組在角質(zhì)層、結(jié)痂或鱗屑處有大量炎癥細(xì)胞聚集。

3.5 病原學(xué)檢查

3.5.1直接鏡檢 除空白組外，各實(shí)驗(yàn)組d 4開始可在顯微鏡下明顯觀察到菌絲，毛發(fā)皮屑中菌絲數(shù)量隨時(shí)間逐漸減少，d 20開始菌絲不明顯，偶可觀察到散在的分生孢子。見Fig 5、Tab 3。

3.5.2逆培養(yǎng) Tab 3結(jié)果顯示，除空白組外，各實(shí)驗(yàn)組接種7 d后培養(yǎng)基開始有菌落生長(zhǎng)，且與接種菌株形態(tài)相同。5、6組陽(yáng)性率最高，7組次之，2組陽(yáng)性率最低。

Tab 3 Positive rate of hairs and scalemicroscopic examination and fungal culture(n=12)

Fig 1 Evaluation index system of skin infection animal model of Trichophyton rubrum

Fig 2 Changes in appearance of guinea pig skin

Fig3Skinsections(PAS staining×100) A～G: Group 1～7.The arrowheads refer to hyphae or spores.

Fig4Skinsections(HE staining×100) A～G:Group 1～7.

Fig 5 Microscopic examination in 10% KOH(×100)

A: Day 4; B: Day 14; C: Day 20; D: Day 26.The arrowhead refers to hyphae.

3.6 免疫學(xué)檢查

3.6.1免疫器官 與1組相比，4、5、6、7組豚鼠的脾臟和胸腺的臟器指數(shù)有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Tab 4)。

GroupSpleen index(g/100g)Thymus index(g/100g)IgM/mg·L-110.180±0.0670.008±0.007268.90±22.6920.178±0.0530.008±0.007383.21±57.90*30.181±0.0610.008±0.006327.50±70.7940.169±0.0360.008±0.005246.82±73.50#50.157±0.0390.006±0.004284.32±53.32#60.166±0.0420.007±0.003303.65±65.9770.151±0.0400.007±0.004308.04±79.95

*P<0.05vsgroup 1;#P<0.05vsgroup 2

Fig 6 Comprehensive score chart of each group

3.6.2免疫功能 IgM出現(xiàn)在感染初期，豚鼠與紅色毛癬菌接觸后會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)自身清除真菌[4,10]。Tab 4結(jié)果表明，與1組相比，其余各實(shí)驗(yàn)組的血清IgM含量都有所升高，其中2組有差異有顯著性(P<0.05)；而與2組相比，4、5、6、7組IgM下降，尤以4、5組比較明顯(P<0.05)，提示長(zhǎng)時(shí)間使用免疫抑制劑干預(yù)能明顯降低豚鼠感染后的自身清除能力。

3.7 模型綜合評(píng)價(jià)結(jié)合外觀病變、直接鏡檢、毛發(fā)皮屑逆培養(yǎng)和皮膚PAS染色陽(yáng)性，模型構(gòu)建成功確定。綜合各指標(biāo)得出，2組模型成功率小于10%，3組成功率30%，4組58%，而5、6、7組均大于75%。取d 14的體征變化和外觀變化結(jié)合其他指標(biāo)，按照模型評(píng)價(jià)指標(biāo)賦分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各項(xiàng)評(píng)分，按權(quán)重計(jì)算獲得各組綜合評(píng)分，按得分高低排序如下：5組>7組>6組>4組>3組>2組，見Tab 5,Fig 6。

4 討論

動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)是一個(gè)多層次、多指標(biāo)的系統(tǒng)，部分評(píng)價(jià)指標(biāo)較難以定量。本研究通過實(shí)例證明，采用AHP構(gòu)建的評(píng)價(jià)體系能較直觀地量化評(píng)價(jià)模型質(zhì)量，從而更好地解決造模方法和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的問題，全面、科學(xué)、可靠地評(píng)價(jià)動(dòng)物模型。紅色毛癬菌具有親人性，而不具有親動(dòng)物性，因而，盡管其在流行病學(xué)調(diào)查中為導(dǎo)致皮膚癬菌感染中的優(yōu)勢(shì)菌種，但難以在動(dòng)物上成模。動(dòng)物皮膚磨損感染是文獻(xiàn)中常見的造模方法，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體皮膚磨損后的真菌感染，同樣對(duì)豚鼠皮膚進(jìn)行磨損接菌，觀察各組紅色毛癬菌感染發(fā)展的全過程。在設(shè)置考察因素時(shí)，我們結(jié)合文獻(xiàn)方法和自身的研究[4]，主要考察重復(fù)感染是否能提高模型成功率，因此，分別進(jìn)行了接菌1 d與接菌2 d的造模研究；考察接受免疫抑制劑處理是否能促進(jìn)紅色毛癬菌感染，以及如何使用免疫抑制劑，因此，比較了不接受免疫抑制劑處理、接受免疫抑制劑處理(曲安奈德、地塞米松聯(lián)用，或單用地塞米松)的差別。結(jié)果表明，正常情況下，不作任何免疫處理的豚鼠感染模型成功率極低，感染后皮膚外觀病征不明顯、自愈速度快、表皮內(nèi)沒有孢子潛伏；而接受免疫抑制劑處理的豚鼠感染模型成功率大大提高，外觀病征明顯，外觀病征褪去后表皮內(nèi)有孢子潛伏；于接菌前后單用地塞米松處理7 d的豚鼠病情發(fā)展和自愈速度相對(duì)較快，聯(lián)合兩種激素處理的豚鼠(由于接菌后隔天注射，前后共10 d)病情發(fā)展和自愈速度較平穩(wěn)，但二者之間差異不是很明顯；接菌2 d的豚鼠比接菌1 d的真菌(兩種方法的總接菌量一樣)感染率更高，模型質(zhì)量更好。

豚鼠對(duì)紅色毛癬菌的自我清除能力強(qiáng)，難以自然感染，降低豚鼠自身的免疫力和重復(fù)接菌可增加易感性[10-11]。本研究中曲安奈德與地塞米松聯(lián)合處理+接菌2 d的模型(5組)綜合得分最高，可認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)中篩選出的最佳紅色毛癬菌感染豚鼠模型。但為了提高模型的可操作性，我們簡(jiǎn)化了處理方法，自行設(shè)計(jì)并研究了單用地塞米松處理的模型(7組)，該模型和5組比較接近；兩種模型的外觀病征都比較明顯[12]，孢子潛伏于表皮、毛囊內(nèi)與臨床病程反復(fù)情況相似[13]，病情發(fā)展和自愈速度適合多數(shù)抗真菌藥物體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)的給藥療程[4,7,14]，有望推廣應(yīng)用于抗真菌藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

Tab 5 Comprehensive score of each group

綜上所述，本研究采用AHP建立的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系清晰、簡(jiǎn)便，優(yōu)選的紅色毛癬菌皮膚感染動(dòng)物模型，為臨床真菌皮膚感染及新型抗真菌藥研究提供了基礎(chǔ)條件。