孫婧文，朱嵩岳，尹 娜，伯 樂，吳晨婷，茅彩萍

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，江蘇 蘇州 215006)

全球約8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育癥[1]，體外受精-胚胎移植術(invitrofertilization & embryo transfer，IVF-ET)為不孕不育患者帶來了生育的希望。過去40年，通過輔助生殖技術診治不孕不育的人數(shù)逐年增加，全球已有超過800萬的試管嬰兒誕生[2]。盡管輔助生殖技術已成功解決了不孕癥患者的生育需求，但近年來，IVF-ET子代的近期和遠期健康風險引起了生殖醫(yī)學界的關注[3]。因為IVF-ET是一種非自然的受孕過程，隨著IVF-ET子代年齡的增長，許多成年發(fā)病的疾病開始顯現(xiàn)[4]。

世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年報告的數(shù)據(jù)顯示：心血管疾病發(fā)病率高，也是全球最常見的死因，每年約可導致1 790萬人死亡，占全球總死亡人數(shù)的31%[5]。已有研究表明，IVF-ET子代存在內分泌代謝紊亂、血管功能障礙等問題[3]。IVF-ET子代血壓輕微升高，但在統(tǒng)計學上表現(xiàn)明顯[3]。外周血管阻力在維持血壓方面也起著重要作用，但IVF-ET中年子代外周血管功能情況的數(shù)據(jù)鮮見報道?；谶@一現(xiàn)狀，本研究擬通過建立IVF-ET子代小鼠模型，探討IVF-ET在診治不孕不育中對其子代血管功能的影響，該研究結果為IVF-ET子代血管相關的易感疾病的預防和早期干預提供重要的實驗理論信息。

1 材料與方法

1.1 實驗動物♂和♀野生型C57BL/6和ICR小鼠，8周齡，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，許可證號：SYXK(蘇)2017-0003。在實驗前，對所有小鼠進行2周的適應性喂養(yǎng)。整個實驗期間喂食標準顆粒飼料，自由飲水，每日于7 ∶00～19 ∶00用燈光照明。所有動物實驗方案均按照中國蘇州大學第一附屬醫(yī)院的倫理委員會規(guī)定進行。

1.2 藥物與試劑孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，購自寧波第二制藥廠；精子獲能液(Toyoda, Yokoyama, Hoshi medium，TYH)、人輸卵管液(human tube fluid，HTF)、CZB培養(yǎng)液(Chatot CL，Ziomek CA，Bavister BD medium，CZB)、KSOM培養(yǎng)液(potassium simplex optimization medium，KSOM)和M2培養(yǎng)液(M2 mouse embryo medium，M2)，購自南京愛貝生物科技有限公司；礦物油，購自瑞典Vitrolife公司；ELISA試劑盒，購自Sino-UK；抗β-actin、Calm2、Itpr1抗體，購自Abcam公司。

1.3 儀器常溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；ABI7500實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher公司)；自動凝膠圖像分析儀(上海培清科技有限公司)。

1.4 體外受精和胚胎培養(yǎng)選取10～12周齡♀ C57BL/6小鼠，通過腹腔注射5 IU(0.1 mL)PMSG刺激排卵。48 h后腹腔注射5 IU(0.1 mL)hCG。取12～14周齡的C57BL/6 ♂小鼠附睪尾內的精子，置TYH培養(yǎng)液中，并在37 ℃、6% CO2的濕潤空氣中獲能50 min。在注射hCG 14 h后，從輸卵管中取出卵丘-卵母細胞復合物放入HTF培養(yǎng)液中。隨后取約106個已獲能精子加入HTF培養(yǎng)液中，在37 ℃和6% CO2環(huán)境下受精6 h。將KSOM和CZB培養(yǎng)液置于37 ℃、6% CO2環(huán)境中預平衡，所述培養(yǎng)液均用礦物油覆蓋。隨后，將受精卵轉移到25 μL的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，胚胎4細胞時轉移進CZB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段。最后將成熟囊胚移植到假孕的♀小鼠宮內。

1.5 胚胎移植在胚胎移植前2.5 d，將至少8周齡的ICR ♀小鼠與輸精管結扎的♂小鼠合籠。交配后次日早晨檢查♀小鼠是否形成陰道栓。在胚胎移植之前，用三溴乙醇(240 mg·kg-1，腹腔注射)麻醉假孕♀小鼠，并且在每側子宮中植入5～7個胚胎，分娩產(chǎn)出的小鼠為實驗組。經(jīng)自然交配出生的子代小鼠為對照組。妊娠期及哺乳期所有母鼠均給予標準鼠糧和水。子代小鼠于4周齡時♀♂分籠。待實驗組和對照組子代生長至中年(20～22周時)，取♂用于實驗。所有子代均來自不同母鼠，n代表小鼠數(shù)量。所有實驗至少重復3次。

1.6 心血管功能相關的細胞因子檢測腹主動脈取血樣，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用ELISA法，NO濃度測定采用比色法，并按照制造商的流程及說明書進行實驗。檢測血清血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)和前列腺素E2(prostaglandin，PGE2)濃度。

1.7 實時定量PCR(qPCR檢測按照RNeasy Mini Kit(德國Qiagen)說明書的步驟，提取實驗組和對照組的子代小鼠腸系膜血管組織總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)將總RNA合成cDNA[6]。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)(TaKaRa公司)和mRNA引物(南京銳真生物有限公司)通過qPCR檢測Itpr1、Calm2、RyR2、RyR3及β-actin的mRNA的水平。反應體系如下：95 ℃ 30 s，然后進行40個循環(huán)的95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s。引物序列見Tab 1。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量，用于mRNA表達分析的生物學重復數(shù)不小于3。

Tab 1 Primer sequences

1.8 蛋白提取和蛋白表達檢測采用Western blot法檢測來自腸系膜血管組織中Calm2和Itpr1的蛋白表達。取腸系膜動脈血管組織液氮中研磨，與裂解液充分混勻，置于冰上靜置15 min，隨后放入4 ℃離心機中，12 000 r·min-1離心30 min，所獲蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，加封閉液于室溫封閉2 h后，按抗體說明書比例加入稀釋的一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入稀釋二抗，室溫孵育1～2 h后，用TBST充分漂洗，而后行曝光等處理，并以β-actin為內參照，采用Image J軟件對灰度值進行分析。每組標本重復檢測3次，取平均值。

2 結果

2.1 IVF-ET對胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔數(shù)的影響實驗組的細胞率為(79.70±10.58)%，囊胚形成率為(80.25±12.67)%，實驗組母鼠的產(chǎn)仔數(shù)為(3.14± 1.21)，明顯低于對照組(5.66± 0.78)(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 IVF-ET對子代小鼠體長、體質量和BMI的影響如Fig 1所示，實驗組小鼠體長為(10.35± 0.36)cm，與對照組體長(10.18± 0.17)cm比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。實驗組小鼠的體質量為(36.65± 4.94)g，明顯高于對照組(P<0.05)。實驗組BMI為(3.41± 0.33)kg·m-2，對照組為(2.93± 0.05)kg·m-2，實驗組BMI明顯高于對照組(P<0.01)。

Fig 1 Effects of IVF-ET on body length(A),

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 IVF-ET對血清AngⅡ、NO、ET-1和PGE2水平的影響Tab 2結果顯示，實驗組血清AngII水平明顯高于對照組(P<0.05)。同時實驗組血清NO濃度明顯低于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組血清ET-1、PGE2水平與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Tab 2 Serum concentration of AngⅡ, NO, ET-1 and PGE2 n=6)

*P<0.05vscontrol

2.4 IVF-ET對子代小鼠腸系膜血管Ca2+信號通路基因表達的影響考慮到Ca2+信號通路在調節(jié)內皮細胞和血管平滑肌細胞血管收縮方面具有重要作用，本研究選擇了4個代表性基因，包括Itpr1、Calm2、RyR2和RyR3進一步研究。Fig 2的qPCR結果顯示，實驗組Itpr1、Calm2、RyR3 mRNA表達明顯高于對照組(P<0.01)，而RyR2 mRNA表達明顯低于對照組(P<0.01)。

Fig 2 Relative mRNA expression of Calm2, Itpr1, Ryr2 and Ryr3 detected by qPCR n= 3)

**P<0.01vscontrol

2.5 IVF-ET對腸系膜血管Itpr1和Calm2受體蛋白表達的影響如Fig 3所示，實驗組與對照組腸系膜血管Itpr1和Calm2受體蛋白表達明顯升高(P<0.01)。

Fig 3 Relative protein expression of Calm2 and Itpr1 detected by Western bolt n= 3)

**P<0.01vscontrol

3 討論

IVF-ET問世以來，越來越多的不孕夫婦通過該技術圓了生育子女的夢想。然而，人們對這一技術的安全性及相關風險知之甚少。盡管一些研究表明，IVF-ET不會增加子代長期的心血管疾病風險[7]。也有研究報道，在表現(xiàn)正常的IVF-ET年輕子代中發(fā)現(xiàn)血管功能障礙、血管衰老和高血壓，這可能使其過早地患上心血管疾病[8]。大部分研究都主要針對IVF-ET對大血管和心臟造成的影響，而有關中年子代長期血管風險的數(shù)據(jù)仍然缺乏。本研究提示，IVF-ET可能對中年子代小血管功能及其調節(jié)功能存在影響。

IVF-ET過程中為了獲取多個同步發(fā)育的卵泡，臨床常用高濃度促性腺激素刺激排卵，而對超過正常生理濃度促性腺激素的影響，尤其是對卵子/胚胎發(fā)育及子代健康影響的研究仍有空白。本實驗通過模擬臨床IVF-ET過程，使用高濃度的PMSG，目的是通過實驗探討其對子代血管相關的生物活性物質及血管功能相關基因蛋白表達的影響及其機制。

已有報道[9]，IVF-ET子代易患肥胖癥和高血壓。本研究數(shù)據(jù)顯示，在相同的正常飲食下，實驗組BMI明顯高于對照組。與先前采用FVB[10]和ICR小鼠[9]的研究結果一致。本研究提示，BMI的上調可能與IVF-ET誘導的胚胎表觀遺傳變化，以及生命后期的環(huán)境因素有關[10]。并且IVF-ET可能改變了參與體質量調控的相關基因。鑒于BMI是心血管疾病的獨立危險因素，IVF-ET子代BMI的升高會增加代謝和心血管疾病的可能性。

腸系膜血管是重要的阻力血管，在調控和維持血壓中起重要作用。研究表明，血管內皮細胞可釋放NO、AngⅡ、ET-1等生物活性物質，參與血管功能和體內代謝平衡的調節(jié)[11]。內皮功能障礙會導致血管舒縮功能障礙、內皮通透性增加等，可增加心血管疾病發(fā)生的可能性。尤其是血管內皮細胞損傷可導致高血壓、動脈粥樣硬化等血管損傷性疾病。ET-1是一種強縮血管物質，同時具有刺激血管內皮細胞以及平滑肌細胞分裂增殖的作用。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)對血管收縮功能具有重要影響，而AngⅡ是RAAS系統(tǒng)中的重要活性物質, 也是一種強效的縮血管活性物質。

已有的實驗研究顯示，遺傳和環(huán)境因素可相互影響，并共同作用于血管NO合成和血壓穩(wěn)態(tài)的調控中[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET子代的血清NO濃度明顯低于對照組，提示體外培養(yǎng)液以及IVF-ET操作過程會對子代小鼠的血管功能產(chǎn)生不利影響。雖然這些發(fā)現(xiàn)的基本機制尚不清楚，但有證據(jù)表明，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是鈣信號通路調控十分重要的基因。由eNOS合成的NO能調節(jié)血管張力，抑制血小板黏附與聚集，改善血管內皮舒張功能。eNOS的作用依賴Ca2+/鈣調蛋白，當血管內皮細胞Calm2表達發(fā)生改變時，將會影響eNOS功能出現(xiàn)障礙, 此時eNOS合成NO減少，造成NO生物利用度降低及氧化應激增加, 導致或加重內皮功能障礙，并且IVF-ET誘導的心血管表型變化與eNOS功能改變有關[13]。此前的報道顯示，與對照組相比，IVF-ET子代的血管一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性明顯降低[10]。由此推斷這種功能上的差異與Ca2+及其信號通路的作用有關。研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET子代腸系膜血管組織中Calm2基因的表達水平明顯高于對照組，證實了上述假設。由此推斷，Calm2基因的異常表達可能導致IVF-ET子代的血管功能障礙。

最新研究表明[14]，Itpr1介導的Ca2+釋放可能在調節(jié)血管收縮和AngII誘導的高血壓及血管平滑肌細胞中發(fā)揮重要作用。AngⅡ與AT1受體結合后，通過激活鳥苷酸(GMP)結合的調節(jié)蛋白，繼而產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)。IP3與內質網(wǎng)上IP3受體(Itpr1)結合，同時L型鈣通道激活后，使細胞攝入鈣和肌漿網(wǎng)釋放Ca2+增多，導致血管功能異常。本實驗結果中檢測到Itpr1高表達，證實了其在整個生存期間對血管收縮的影響。本研究數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，實驗組RyR2、RyR3的表達水平存在很大差異。眾所周知，Itpr1和RyR3的表達升高可能通過鈣信號通路導致Calm2表達升高。在所有這些改變的共同作用下，IVF-ET可能會對子代血管調節(jié)功能產(chǎn)生不利影響。由此認為，當遇到高碳水化合物飲食、高脂肪飲食以及其他不健康的生活方式時，這種相互作用帶來的不利后果將更加嚴重。

由于與體外受精-胚胎移植相關的多種因素的存在，目前尚無法證明IVF-ET過程導致的影響是否可獨立于母體環(huán)境，并成為成年疾病發(fā)生、發(fā)展的主要影響因素。今后將繼續(xù)研究IVF-ET中多個操作步驟等對子代生命健康的影響，并進一步研究老年子代，以獲得更多關于IVF-ET對子代長期影響的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究顯示，IVF-ET子代存在肥胖的傾向及血管相關的如高血壓等疾病的易感性。本研究首次提出IVF-ET對子代高血壓相關的一組基因Itpr1、Calm2的表達，以及對中老年小鼠微血管功能調節(jié)產(chǎn)生影響，為進一步研究IVF-ET影響子代高血壓的相關機制提供了重要信息和理論依據(jù)，為預防及早期采取適當?shù)母深A措施，避免IVF-ET子代血管相關疾病的發(fā)生提供了重要的科學指導。

(致謝：本實驗主要在蘇州大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心實驗室內完成，在此對實驗室各位老師、同學的指導和幫助表示衷心的感謝！)