趙慶一, 楊蕓蕓, 張新月, 范明峰

(江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院 眼科, 江蘇 張家港, 215600)

近視作為一種復(fù)雜的多因素疾病，正困擾著全世界近一半的年輕人，而對(duì)其發(fā)病機(jī)制及防治方法的探討是目前的研究熱點(diǎn)[1]。近視屈光度在-6.0 D以上的被稱(chēng)為高度近視，是目前導(dǎo)致視力下降和失明的主要眼病，球后部鞏膜呈進(jìn)行性異常擴(kuò)張且逐漸變薄，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)改變是高度近視不斷發(fā)展的根本原因。近年來(lái)，中醫(yī)治療高度近視眼病多有報(bào)道，主要采用一些補(bǔ)腎益精類(lèi)的中藥進(jìn)行治療，并取得了一定的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)遮蓋法，人為干擾豚鼠正常的視覺(jué)反饋，從而誘導(dǎo)出形覺(jué)剝奪性近視模型[2-3], 并利用電鏡檢測(cè)，從組織形態(tài)角度觀察五子衍宗方對(duì)模型動(dòng)物鞏膜結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組: 選擇100只2周齡普通級(jí)三色健康豚鼠，記錄體質(zhì)量在180～200 g并標(biāo)記，飼養(yǎng)條件為20～22 ℃室內(nèi)飼養(yǎng)，光線改變按自然晝夜周期，造模前先喂養(yǎng)1周。豚鼠雙眼屈光度檢查采用暗室內(nèi)帶狀檢影鏡檢影驗(yàn)光的方法，記錄造模前豚鼠雙眼屈光度，為減少誤差，由同一位熟練操作者操作。半透明塑料眼罩遮蓋右眼，以誘導(dǎo)形覺(jué)剝奪性近視模型的建立，左眼為自身對(duì)照眼，不做處理。正常飼養(yǎng)42 d后，再次進(jìn)行帶狀檢影鏡檢影驗(yàn)光，隨機(jī)處死1只豚鼠，摘出眼球，游標(biāo)卡尺測(cè)量眼軸長(zhǎng)度及赤道徑，確定造模成功。剔除死亡實(shí)驗(yàn)鼠，將剩余60只實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及治療組，每組30只。對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)，治療組以五子衍宗方灌胃給藥30 d后，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及制備: 實(shí)驗(yàn)中使用的五子衍宗方具體組成為炙黃芪20 g、生地12 g、菟絲子12 g、枸杞子12 g、覆盆子12 g、車(chē)前子10 g、五味子10 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、石斛10 g。上述藥物均一次性購(gòu)于本院門(mén)診藥房，使用清潔涼水浸泡藥物30 min后，分別加10倍水、8倍水煎煮60、40 min, 2次煎煮所得藥液經(jīng)混合過(guò)濾，濃煎至4 g/mL。根據(jù)動(dòng)物體表面積折合法計(jì)算治療組豚鼠生物給藥量為16 g/kg。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備: SW-2100眼科A/B型超聲診斷儀(天津市索維電子科技有限公司), BX51顯微鏡(OLYMPUS), LEICA255鋪片機(jī), BM450A包埋機(jī)(派斯杰醫(yī)療)，帶狀檢影鏡(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司), 4%多聚甲醛固定液(北京華越洋生物科技有限公司)，二甲苯(濟(jì)南匯豐達(dá)化工公司), 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京華越洋生物科技有限公司), LEICA300自動(dòng)脫水機(jī)，乙醇(濟(jì)南匯豐達(dá)化工公司)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)雙眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度: 每5 min使用1%復(fù)方托吡卡胺點(diǎn)雙眼，共3次，以作散瞳準(zhǔn)備, 30 min后于暗室內(nèi)檢影驗(yàn)光，散光度數(shù)(D)記作等效球鏡的一半(檢影驗(yàn)光由同一位專(zhuān)業(yè)人員操作完成)。鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)雙眼表面麻醉后, A/B型超聲診斷儀手動(dòng)測(cè)量眼軸長(zhǎng)度，記錄雙眼結(jié)果，剔除明顯異常數(shù)據(jù)后取平均值。造模后重復(fù)檢查1次。

1.2.2 電鏡觀察: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，氯胺酮麻醉豚鼠以便操作，標(biāo)記后立即摘除雙側(cè)眼球，小心剔除多余組織，取眼球后部顳側(cè)眼球壁鞏膜組織切成，用無(wú)齒鑷剝離大小約1 mm×1 mm鞏膜組織塊，置于25 g/L戊二醛溶液中固定, 10 g/L鋨酸固定，乙醇梯度脫水、浸透包埋、固化、切片，枸櫞酸鉛染色, JEM-120OEX透射電鏡觀察、拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)豚鼠造模前后屈光度結(jié)果和眼軸結(jié)果，同樣采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)豚鼠造模后左、右眼屈光度結(jié)果和眼軸結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙眼屈光度及眼軸

100只豚鼠經(jīng)正常喂養(yǎng)1周后，檢測(cè)右眼的屈光度、眼軸和左眼的屈光度、眼軸。造模前所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象雙眼屈光度與眼軸相匹配，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。遮蓋右眼42 d以誘導(dǎo)形覺(jué)剝奪性近視，再次檢測(cè)模型眼(右眼)的屈光度、眼軸及對(duì)照眼(左眼)的屈光度、眼軸。對(duì)比自身對(duì)照眼，模型眼誘導(dǎo)了約(-8.24±1.04) D的相對(duì)近視，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3周齡豚鼠的左、右眼眼軸長(zhǎng)度無(wú)顯著差異。形覺(jué)剝奪42 d后，模型眼的眼軸顯著增長(zhǎng)，較實(shí)驗(yàn)前結(jié)果差異顯著(P<0.05)。自然成長(zhǎng)42 d后，對(duì)照眼的眼軸也隨之增長(zhǎng)，較實(shí)驗(yàn)前結(jié)果差異顯著(P<0.05)。模型眼的眼軸變化平均幅度大于對(duì)照眼。見(jiàn)表1。

表1 豚鼠造模前后屈光度和眼軸的變化

與右眼比較, *P<0.05; 與造模前比較, #P<0.05。

2.2 鞏膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，治療組模型眼和對(duì)照組模型眼后部顳側(cè)鞏膜厚度相較于自身對(duì)照眼均有不同程度降低，對(duì)照組對(duì)照眼鞏膜膠原纖維間隙較小，排列緊致，纖維走向規(guī)則，其中均勻分布鞏膜成纖維細(xì)胞且形態(tài)均一，未見(jiàn)典型凋亡細(xì)胞。對(duì)照組模型眼鞏膜膠原纖維走行紊亂，排列間隙增寬擴(kuò)大，纖維束疏松，斷裂明顯，其間成纖維細(xì)胞分布不均勻，呈柳葉狀改變，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，染色質(zhì)固縮周邊化，同時(shí)可見(jiàn)空泡及典型凋亡小體，細(xì)胞外基質(zhì)減少。治療組模型眼鞏膜膠原纖維走行欠規(guī)則，排列可見(jiàn)間隙，可見(jiàn)少量斷裂纖維束，其間分布成纖維細(xì)胞部分出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞內(nèi)有空泡形成，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞形態(tài)改變。見(jiàn)圖1。

A、B、C、D為對(duì)照組模型眼, E、F、G、H為治療組模型眼; A、C、D、G放大倍數(shù)6 000倍, B、E、F、H放大倍數(shù)2 500倍。圖1 2組豚鼠后部顳側(cè)鞏膜組織電鏡檢查圖

3 討 論

動(dòng)物模型的應(yīng)用可讓實(shí)驗(yàn)更加直觀，為研究近視疾病的病因及進(jìn)展提供了極有價(jià)值的數(shù)據(jù)。豚鼠具有生長(zhǎng)快、成熟周期短、易飼養(yǎng)、易檢查等特點(diǎn)[4], 目前被大量用為實(shí)驗(yàn)性近視的模型動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M先天性屈光介質(zhì)混濁或后天性上瞼下垂誘發(fā)高度近視，通過(guò)遮蓋干擾小周齡豚鼠的正常視覺(jué)反饋，從而誘導(dǎo)出形覺(jué)剝奪性近視模型。對(duì)近視動(dòng)物模型的形態(tài)學(xué)研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，高度近視眼鞏膜纖維層變薄，尤其是后極部，鞏膜膠原、蛋白多糖等含量明顯減少，膠原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。隨著眼球發(fā)育及近視度數(shù)的加深，眼軸的進(jìn)一步延長(zhǎng)，為匹配增大的眼球，后極部鞏膜組織主動(dòng)重塑、拉伸以協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，造成膠原纖維梯度排列變化、纖維直徑分布紊亂、組織結(jié)構(gòu)重塑，最終導(dǎo)致眼球前后徑異常伸長(zhǎng)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電鏡觀察到治療組模型眼及對(duì)照組模型眼鞏膜組織均有不同程度的結(jié)構(gòu)改變，鞏膜膠原纖維走行欠規(guī)則，排列間隙增寬擴(kuò)大，纖維束疏松，斷裂明顯，其間成纖維細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)空泡，線粒體腫脹，染色質(zhì)固縮周邊化，呈鐮刀狀改變，并可見(jiàn)典型凋亡小體，細(xì)胞外基質(zhì)減少。這一結(jié)果與研究[10]報(bào)道的高度近視豚鼠鞏膜超微結(jié)構(gòu)變化一致。Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法[11-12]也證實(shí)了高度近視眼鞏膜組織存在細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)認(rèn)為“目得血而能視”“五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，說(shuō)明眼睛之所以能有視覺(jué)功能，必須依賴(lài)于五臟六腑精氣及血液的滋養(yǎng)。腎、脾互為先后天之本，是人體氣血生化之源。脾腎兩虛者，生化乏源，又則肝開(kāi)竅于目，肝血虛者，目不能養(yǎng)，故發(fā)為高度近視。五子衍宗方是由補(bǔ)腎名方五子衍宗丸加減得來(lái)，全方補(bǔ)腎益精，健脾益氣，養(yǎng)肝明目，生津活血，使得氣血運(yùn)行通暢，精氣充足滋養(yǎng)于目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組模型眼，治療組模型眼的近視進(jìn)程及眼軸增長(zhǎng)相對(duì)較為緩慢，其鞏膜組織超微結(jié)構(gòu)變化也相對(duì)較小，這說(shuō)明治療組模型眼近視進(jìn)程得到了抑制。有實(shí)驗(yàn)[13-15]證實(shí)，五子衍宗丸的活性成分可通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化而起到神經(jīng)保護(hù)和改善神經(jīng)病理?yè)p傷的作用。推測(cè)五子衍宗方可能通過(guò)某種途徑改善鞏膜膠原纖維結(jié)構(gòu)異常改變，延緩眼軸增長(zhǎng)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。