劉 娟, 陳燦明, 徐 楊, 張 偉, 張 磊

(江蘇省揚州市婦幼保健院 婦產科, 江蘇 揚州, 225000)

子宮內膜異位癥(EMT)簡稱內異癥，是育齡女性的常見病和多發(fā)病，嚴重影響女性的生活和健康[1-3]。研究[4-7]發(fā)現EMT可能與二噁英暴露有關，但其具體機制不明，對其進行分子學研究[8-10]發(fā)現，二噁英促內異癥發(fā)展可能是通過改變芳香烴受體(AhR)介導的信號通路中相關基因的表達。EMT疾病的復雜性需要考慮到基因-基因交互關系在疾病中的作用。本研究探討AhR信號通路相關基因[AHR、AhR核異位蛋白(ARNT)、細胞色素P450 1A1(CYP1A1)、AhR 阻遏蛋白(AhRR)、谷胱甘肽S轉移酶1(GSTP1)、白細胞介素-1β(IL-1β)]的基因多態(tài)性，基因的mRNA以及基因-基因交互作用與EMT發(fā)病的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例-對照研究，病例組為2016年12月—2019年1月揚州市婦幼保健院經手術病理確診的卵巢EMT患者25例，平均年齡(38.46±8.74)歲。對照組為同期因盆腔包塊在揚州市婦幼保健院經手術病理確診非EMT患者25例，平均年齡(39.96±18.68)歲。病例組納入標準: ① 手術病理確診EMT; ② 臨床病例資料完整。排除標準: ① 存在交流溝通障礙或精神疾病患者; ② 哺乳期; ③ 拒絕參加臨床調查者; ④ 存在血緣或親屬關系。根據1997年美國生育學會(AFS)提出的“修正子宮內膜異位癥分期法”對EMT進行分期。2組年齡、職業(yè)、生育史等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。所有患者均告知研究目的并簽署知情同意書。研究方案經院倫理委員會審查并通過。

1.2 研究方法

1.2.1 實時定量PCR法檢測mRNA表達: 采集靜脈血1 mL加1 mL Trizol后室溫放置5 min, 放入-80 ℃冰箱，按照百泰克《血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒使用手冊》完成總RNA提取，提取RNA進行逆轉錄，用實時定量PCR技術檢測AHR、ARNT、CYP1A1、GADPH、GSTP1和IL-1β共6個基因的mRNA表達水平，引物由上海啟因生物科技有限公司設計合成，看家基因選擇GAPDH。實驗操作嚴格按照產品說明書進行。引物序列見表1。

表1 引物序列及PCR產物大小

1.2.2 AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多態(tài)性檢測: 抽取2組靜脈血2 mL, 置于含有乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝的5 mL試管，用鹽析法提取DNA，采用定量PCR為基礎的高分辨率熔解曲線(PCR-HRM)法檢測AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因單核苷酸位點，包括AHRG 1661A: rs2066853, ARNT G522C: rs2228099, AHRR C565G: rs2292596, CYP1A1 T6235C: rs4646903, GSTP1 A313G: rs1695, IL-B C3953T: rs1143634。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行數據處理。計量資料采用均數±標準差表示, 2組間計量資料用t檢驗進行分析。病例組和對照組基因多態(tài)位點基因型頻率分別行Hardy-Weinberg平衡檢驗,P>0.05表明所選樣本已達遺傳平衡。計數資料用率表示，用卡方檢驗或Fisher確切概率法分析組間各基因型頻率分布的差異，計算優(yōu)勢比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)。用單純病例研究方法，采用非條件Logistic多元回歸模型中交互作用的相乘模型分析基因-基因之間的交互作用,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

所有患者中近半數人員職業(yè)為職員(48.00%), 其他職業(yè)還包括教師、農民、服務人員、醫(yī)護人員、個體、學生、退休和無業(yè)。病例組與對照組在年齡、職業(yè)、生育和規(guī)律月經方面差異無統計學意義(P>0.05)。病例組中大部分患者為中重型，內異癥分期Ⅲ～Ⅳ期(19/25，76.00%)。

2.1 病例組與對照組mRNA的表達水平

與對照組比較，病例組中AHR mRNA、GSTP1 mRNA和IL-1β mRNA水平顯著增高(P<0.01)。病例組中ARNT mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05), 見表2。

表2 病例組與對照組6個基因mRNA的表達水平

與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 病例組與對照組各基因位點頻率分布的比較

6個基因多態(tài)性位點的基因頻率分布在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，納入樣本符合人群代表性。病例組與對照組中AHR 1661 G/A以GA基因型最常見; AA基因型最少見，ARNT 522 G/C以CG基因型最常見，GG基因型少見; AHRR 565 C/G以CG基因型最常見，GG基因型最少見; GSTP1313 A/G以基因型AA最常見，GG最少見。IL-1β 3953 C/T全部為野生型基因CC型，未見基因突變。CYP1A1 6235 T/C以TC基因型最常見，然而攜帶突變基因型CC患者EMT的危險度是純合野生型的7.5倍(95%CI為1.29～43.69)。其他基因型的分布無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 AHR、ARNT、AHRR、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多態(tài)性在病例組與對照組中分布[n(%)]

2.3 各基因型在EMT發(fā)病中的交互作用

CYP1A1 6235 T/C突變型與ARNT 522 G/C(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48)、GSTP1313 A/G突變型(OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98)存在協同作用。AHR 1661 G/A突變型與AHRR 565 C/G突變型存在協同作用(OR=13.50, 95%CI: 1.34～159.98), 其他基因位點未見交互作用。見表4。

表4 基因-基因在EMT發(fā)病中的交互作用

3 討 論

二噁英對人體的毒害作用主要是由AhR介導。AhR與二噁英具有高度親和力，未與二噁英結合的AhR位于細胞漿，處于一種非活化狀態(tài)，與二噁英結合的AhR轉入細胞核與ARNT相互作用而形成轉錄激活因子，結合到靶基因的DNA基序生物異源物質效應元件(XRE), 啟動靶基因轉錄，研究較多的靶基因包括細胞色素P450基因組、谷胱甘肽S轉移酶(GSTP)、炎性細胞因子如白介素1等。另外, AhR阻遏蛋白(AhRR)也會被AhR激活，競爭性地與ARNT結合，作用于靶基因，遏制AhR-ANRT對基因的轉錄[12]。二噁英和EMT的發(fā)病的關系可能與這些解毒代謝途徑相關基因的多態(tài)性有關。

3.1 單個基因多態(tài)性與EMT的關系

本研究檢測了AhR介導的信號通路中6個基因6個位點的單核苷酸多態(tài)性的基因型分型。就單個基因而言，只有1個基因的單核苷酸多態(tài)性位點與EMT發(fā)病有關聯，即攜帶CYP1A1-6235 T/C突變型CC基因型患EMT的風險增加(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。CYP1A1屬于細胞色素P450酶系(CYP450s), 是二噁英重要的I相代謝酶，其功能是激活無活性的前致癌物為致癌物。因機體的細胞在復制過程中會發(fā)生基因突變，所以可能導致細胞色素CYP1A1表現出多態(tài)性，對環(huán)境毒素的催化特性不同，在機體表現為發(fā)生疾病的不同易感性。研究[13]發(fā)現和攜帶CYP1A1 MspI基因型(-/-)的女性相比，攜帶CYP1A1 MspI(+/-)和(+/+)的女性有40%的風險發(fā)生EMT。此外，國內學者[14]報道吉林市漢族婦女中CYP1A1Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型與EMT的易感性有關。但也有文獻[15-17]報道了不一樣的結果，否認二者之間存在關聯性。研究結果的不一致可能與研究人群、基因型、遺傳背景、種族差異、樣本量以及環(huán)境污染暴露程度不同等多個因素有關。本研究人群中未發(fā)現其他的單個基因多態(tài)性和內異癥之間的關系，與部分文獻[15, 18]結果一致。

3.2 聯合基因多態(tài)性和EMT的關系

本研究發(fā)現CTP1A1 6235 T/C與ARNT 522G/C，CTP1A1 6235 T/C與GSTP1 313 A/G基因突變型之間的協同作用增加EMT的發(fā)病風險(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48;OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98), 比CTP1A1 6235 T/C單個基因多態(tài)性增加內異癥的風險更大(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。國內學者[19]報道吉林市漢族婦女CYP1A1 Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型及GSTM1空白基因型二者的協同作用與EMT的易感性有關。另有學者[20]報道CYP1A1基因MspI多態(tài)性本身可能與維吾爾族及漢族內異癥發(fā)病無關，而CYP1A1/MspI合并GSTM1(-/-)基因型可能與維吾爾族內異癥發(fā)病有關。近期的1篇Meta分析[21]也得出類似結論。CYP1A1和GSTP1同屬于解毒代謝酶，根據功能分為Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶。CYP1A1屬于Ⅰ相代謝酶，其主要功能是激活活化環(huán)境毒物并結合形成親電子中間產物，呈現毒性。GSTP1屬于Ⅱ相代謝酶，其主要功能是將Ⅰ相代謝酶活化的毒物解毒，轉化為無毒物質排出。因此如果編碼Ⅰ和Ⅱ相代謝酶的某個基因位點多態(tài)性，可能會造成酶活性的改變，使得毒性物質提前被激活或解毒能力降低，不能轉變成無毒物質排出體外，從而使機體對疾病的易感性增加。另外，本研究發(fā)現AHR1661 G/A與AHRR565 C/G基因突變型間的協同作用與EMT的易感性有關。AHRR的主要作用是拮抗AhR介導的信號途徑，但基因位點上多態(tài)性改變，可能會引起功能異常。在臺灣的漢族人群中調查也發(fā)現野生型AhR和突變型的AHRR間協同作用增加近3倍的內異癥發(fā)病風險[22]。

3.3 基因多態(tài)性和基因mRNA表達

炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)與EMT的發(fā)病有關[23]。本研究發(fā)現EMT患者血液中IL-1β mRNA的含量明顯增高。但IL-1β基因3953位點CC基因型與內異癥發(fā)病風險無關，本研究結果與其他中國漢族人群的報道[24-26]相符。其原因是本研究僅檢測IL-1β基因上一個位點，而基因上分布多個SNP, 推測可能是基因序列上其他位點的改變調節(jié)了IL-1β的轉錄，據報道IL-1β表達與3953位點多態(tài)性之間無相關性[27-29]，需要探索其他功能性位點。本研究中CYP1A1基因的多態(tài)性與內異癥易感性有關，同時也檢測出病例組中CYP1A1mRNA水平高于對照組。此外，本研究結果表明內異癥患者血液中AhR mRNA和GSTP1 mRNA水平明顯增加，但這些基因的多態(tài)性僅在與其他基因多態(tài)性聯合作用時才表現出與疾病易感的相關性。另外，病例組中ARNT mRNA水平較在對照組中明顯增加，該基因的多態(tài)性與疾病無相關性，但其與CYP1A1基因多態(tài)性突變型基因間的交互作用與疾病的發(fā)生風險有關?？紤]到基因位點上的改變可能會影響基因的轉錄，繼而出現表達的異常，所以本研究檢測基因SNP同時檢測相應基因的mRNA, 但出現的結果較復雜，對這一現象的解釋可能需要離體試驗及擴大樣本量進一步驗證。