黃瑾， 陳相好， 吳曉娟， 張崢嶸， 谷俊瑩， 陳崢宏**， 崔古貞**

(1.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

Ⅱ型內(nèi)含子(group II introns)是一類具有自我剪接功能、可在染色體不同位置移動的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，廣泛存在于細菌、古細菌和植物的細胞器基因組中[1-2]。來源于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的Ll.LtrB內(nèi)含子由內(nèi)含子RNA和內(nèi)含子編碼蛋白(intron-encoded protein，IEP)兩部分組成，其中內(nèi)含子編碼蛋白IEP由反轉(zhuǎn)錄結構域、成熟酶結構域、DNA結合域和核酸內(nèi)切酶結構域等多個功能結構域組成[2-6]。Ⅱ型內(nèi)含子發(fā)揮功能時，IEP蛋白利用其核酸內(nèi)切酶活性切割靶位點，并通過其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄活性將內(nèi)含子RNA以cDNA的形式插入到靶位點，最后細胞通過修復機制再以cDNA為模板合成互補DNA，從而將內(nèi)含子RNA以DNA的形式插入到DNA靶位點[6-8]?；冖蛐蛢?nèi)含子的這種遷移特性開發(fā)出的Targetron基因打靶技術被廣泛應用于多個物種的基因失活[8-19]。本研究以課題組前期建立誘導型targetron質(zhì)粒為基礎，選擇大腸桿菌lacZ-1683a和lacZ-1874s為靶位點，構建了兩種Targetron打靶載體，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后驗證其功能及其效率，為下一步對Ⅱ型內(nèi)含子的移動機制研究及應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和DNA Marker購自北京全式金公司，TRYPTONE、YEAST EXTRACT購自美國OXID公司，瓊脂糖、Agar Powder、氨芐青霉素、X-gal以及IPTG購自索萊寶公司，限制性內(nèi)切酶XhoI和BsrGI購自賽默飛公司，菌落PCR所使用的2×Taq Master Mix購自諾唯贊公司，DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司。

1.1.2菌株的培養(yǎng) 菌株均用LB液體培養(yǎng)基(1% Tryptone，0.5%Yeast Extract，1%NaCl)37 ℃進行培養(yǎng)，必要時加入1.5% Agar Powder配制成LB固體培養(yǎng)基，采用100 mg/L氨芐青霉素，藍白斑篩選時加入40 mg/L X-gal和0.1 mmol/L IPTG。

1.1.3菌株及質(zhì)粒 所用的菌株及質(zhì)粒見表1。

表1 所用菌株及質(zhì)粒的特征和來源Tab.1 Strains and plasmids used in this study

注：(1)表示該質(zhì)粒已在生物技術通報中使用(《生物技術通報》2019年35卷6期，已錄用、待發(fā)表)

1.1.4引物 引物合成由上海生工合成，詳細序列信息見表2。

1.2 方法

1.2.1打靶引物設計 將大腸桿菌BL21(DE3)的lacZ全基因序列輸入到在線網(wǎng)址(www.clostron.com)，根據(jù)評分高低，選擇lacZ基因反義鏈第1 683位點(lacZ-1683a)及正義鏈第1 874位點(lacZ-1874s)作為打靶位點，在線設計程序會給出相應位點的打靶引物序列，每個位點會給出4種引物(lacZ-1683a-IBS、lacZ-1683a-EBS1d、lacZ-1683a-EBS2以及EBS Universal)，詳細引物序列見表2。

表2 引物序列及描述Tab.2 Primers used in this study

1.2.2打靶載體的構建 以pSY7質(zhì)粒為模板，用相應打靶位點的引物(lacZ-1683a-IBS/EBS Universal和lacZ-1683a-EBS2/lacZ-1874s-EBS1d)進行第一輪PCR，條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為30，PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒回收特異條帶，以第一輪的PCR產(chǎn)物及打靶位點引物(lacZ-1683a-IBS lacZ-1874s-EBS1d)進行第二輪PCR，PCR條件同上，產(chǎn)物再采用DNA純化試劑盒回收特異性條帶。利用限制性內(nèi)切酶XhoI/BsrGI雙酶切質(zhì)粒pSY7和第二輪PCR產(chǎn)物，通過DNA凝膠試劑盒回收，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5a，菌落PCR鑒定及測序后獲得打靶載體pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s。見圖1。

圖1 打靶載體pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s的構建流程Fig.1 Flow chart of Targetron vectors construction

1.2.3大腸桿菌BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化 將3 μL的質(zhì)粒pSY7-lacZ-1683a、pSY7-lacZ-1874s分別加入到50 μL大腸桿菌的BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰上孵育30 min，42 ℃熱激90 s后，置于冰上5 min，加入900 μL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min復蘇1 h后，離心取細胞沉淀加入100 mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基5 mL中，37 ℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)。

1.2.4打靶載體功能的檢測 取40 μL過夜培養(yǎng)的菌液加入100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基4 mL中，37 ℃ 200 r/min進行增菌培養(yǎng)1 h，再加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導質(zhì)粒表達45 min，離心取細胞沉淀稀釋凃布LB平板(含100 mg/L氨芐青霉素、40 mg/L X-gal和0.1 mmol/L IPTG)，37 ℃過夜，挑取平板上的白色菌落和藍色菌落進行菌落PCR驗證以檢測內(nèi)含子序列插入基因組的特異性，通過藍白斑計數(shù)計算打靶效率，打靶效率=白斑/(白斑+藍斑)×100%。

2 結果

2.1 打靶載體的構建

圖2A為第一輪PCR的電泳圖，成功擴增出兩個打靶序列0.1 kb和0.25 kb的特異性條帶；圖2B為進行第二輪PCR的電泳圖，成功將第一輪PCR的0.1 kb和0.25 kb的產(chǎn)物進行了連接；圖2C為所構建質(zhì)粒菌落的PCR結果，可見明顯的0.35 kb的打靶序列條帶。通過測序，表明本研究成功構建了打靶載體pSY7-lacZ-1683a、pSY7-lacZ-1874s。

注：M為8 000 Marker，A為第一輪PCR，1為lacZ-1683a-IBS/EBSU，2為lacZ-1683a-EBS2/lacZ-1683s-EBS1d，3為lacZ-1874s-IBS/EBSU，4為lacZ-1874s-EBS2/lacZ-1874s-EBS1d；B為第二輪PCR，1為lacZ-1683a-IBS/lacZ-1683a-EBS1d，2為lacZ-1874s-IBS/lacZ-1874s-EBS1d；C為菌落PCR，1為lacZ-1683a-IBS/lacZ-1683a-EBS1d，2為lacZ-1874s-IBS/lacZ-1874s-EBS1d圖2 打靶載體構建電泳結果Fig.2 Electrophoresis detection for Targetron construction

2.2 打靶載體的功能檢測

如圖3所示，當用打靶位點的上下游引物進行菌落PCR時，白色菌落比野生型藍色菌落多了0.9 kb的條帶大小，而且通過特異性引物進行菌落PCR，可得到相應大小的條帶，表明本研究所構建的打靶載體經(jīng)過誘導后，內(nèi)含子序列成功的特異性地插入了相應的打靶位點。

2.3 Targetron載體的打靶效率

如圖4所示，lacZ-1683a的打靶效率為(14.299±1.271)%，lacZ-1874s的打靶效率為(9.217±1.024)%。

3 討論

來源于乳酸乳球菌的Ll.LtrB內(nèi)含子是目前研究得最為廣泛的細菌Ⅱ型內(nèi)含子，基于其在細菌中的特異轉(zhuǎn)移機制，已被開發(fā)為高效的Targetron基因打靶技術[9,14,18,20-21]。由于該技術操作簡便，實驗周期短，基因打靶效率高等優(yōu)點，已在多種革蘭氏陽性菌及革蘭陰性菌中獲得廣泛應用[8]。根據(jù)Ⅱ型內(nèi)含子的靶位點識別機制，已開發(fā)出通用的特異性打靶引物設計軟件，并可利用在線設計軟件(www.clostron.com)，僅輸入靶基因即可自動生成特異性引物，并獲得各打靶位點的評分情況；其次，在基因打靶載體構建方面，通過重疊延伸PCR獲得特異性的內(nèi)含子打靶序列，結合單次質(zhì)?？寺。憧色@得針對目標基因的打靶載體。本研究以大腸桿菌lacZ基因為例，設計并構建了針對lacZ-1683a和lacZ-1874s兩個位點的Targetron載體，通過轉(zhuǎn)化、誘導及菌落PCR驗證獲得較好的打靶效率?？傊狙芯砍晒嫿ǖ腡argetron打靶載體為Ⅱ型內(nèi)含子的機理研究及應用奠定了基礎。

注：M為8 000 Marker，A為打靶載體功能檢測所用引物示意圖，B為插入位點外側(cè)引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1683a 突變株、1為lacZ-1/lacZ-2引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1683a、2為lacZ-1/lacZ-2引物檢測BL21(DE3)，C為特異性 引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1683a突變株、1為lacZ-1/lacZ-1683a-IBS、2為lacZ-1/lacZ-1683a-EBS2、3為lacZ- 1683a-EBS1d/lacZ-2、4為EBSU/lacZ-2，D為插入位點外側(cè)引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1874s突變株、1為 lacZ-1/lacZ-2引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1874s、2為lacZ-1/lacZ-2引物檢測BL21(DE3)，E為特異性 引物檢測BL21-pSY7-lacZ-1874s突變株、1為lacZ-1/ lacZ-1874s-EBS1d、2為lacZ-1/ EBSU、 3為lacZ-1874s-IBS/lacZ-2、4為lacZ-1874s-EBS2/lacZ-2圖3 打靶載體的功能檢測Fig.3 Function verification of Targetron vectors

圖4 Targetron載體的打靶效率Fig.4 Targeting efficiency of Targetron vectors