聶新穎 廖紅梅 劉元法

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，屬于革蘭氏陰性腸道桿菌，其血清型具有致病性[1]。該病原菌主要寄居于胃腸道，引起胃腸道感染，其菌型繁多，分布廣泛[2]。在全球食物中毒引發(fā)的安全事件中，由沙門氏菌引起中毒的病例常居于首位。據(jù)報(bào)道[3]，細(xì)菌性腹瀉導(dǎo)致全球每年23萬(wàn)人左右死亡，其中很大一部分是由沙門氏菌感染引起的。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovar Typhimurium)是近年來(lái)報(bào)道頻率較高的血清型之一[4]，可通過(guò)污染食物造成人類腸道感染或畜禽腹瀉，是重要的人畜共患病原菌；每年因鼠傷寒沙門氏菌引起的感染占沙門氏菌感染總量的20%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)是指某些微生物遇到不利環(huán)境進(jìn)入的一種特殊休眠狀態(tài)[6]。處于該狀態(tài)的微生物在常規(guī)培養(yǎng)基上不能形成菌落，但仍保留呼吸、代謝活性、膜完整性和微弱基因轉(zhuǎn)錄，在合適的條件下又可恢復(fù)可培養(yǎng)性[7]。因此，食源性致病菌一旦進(jìn)入VBNC狀態(tài)，可能會(huì)漏檢進(jìn)而造成食品安全事故及至危害人類健康。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道光[8]、低溫[9]、寡營(yíng)養(yǎng)[10]、過(guò)氧化氫[11]、次氯酸鈉[12]等處理能夠誘導(dǎo)沙門氏菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

早在18世紀(jì)便發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫，并在食品、飲料、醫(yī)療器械和衛(wèi)生保健領(lǐng)域廣泛運(yùn)用。過(guò)氧化氫的使用主要依賴其氧化性，不同濃度的過(guò)氧化氫具有不同的用途。一般醫(yī)用過(guò)氧化氫(俗稱雙氧水)使用濃度為3%[13]，工業(yè)用過(guò)氧化氫濃度一般為25%～50%[14]。與工業(yè)級(jí)過(guò)氧化氫不同，食品級(jí)的過(guò)氧化氫中沒(méi)有蒽醌類有機(jī)雜質(zhì)，以及鉛砷等對(duì)人體有害的金屬物質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于果汁、飲料、乳品、飲用水、啤酒、果蔬保鮮以及無(wú)菌包裝等食品的生產(chǎn)和消毒[15]。已有文獻(xiàn)[16]報(bào)道低濃度過(guò)氧化氫會(huì)使培養(yǎng)基中腸炎沙門氏菌進(jìn)入VBNC休眠狀態(tài)，造成生物漏檢。然而，至今卻無(wú)研究揭示低濃度過(guò)氧化氫處理使鼠傷寒沙門氏菌形成VBNC狀態(tài)的機(jī)制。

本試驗(yàn)擬研究自來(lái)水體系中食品級(jí)過(guò)氧化氫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的影響，并通過(guò)分析掃描電鏡、透射電鏡、相關(guān)胞內(nèi)酶活、自由基產(chǎn)生與鼠傷寒沙門氏菌活性及可培養(yǎng)性的關(guān)系以探究其VBNC態(tài)的產(chǎn)生機(jī)制，旨在為過(guò)氧化氫在食品工業(yè)中殺菌消毒領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)CMCC 50115：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保菌管理中心(National Center for Medical Culture Collections，CMCC)。

鼠傷寒沙門氏菌采用BPY(Beef Peptone Yeast)培養(yǎng)基[牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、酵母粉5 g/L 和葡萄糖5 g/L，pH (7.0±0.2)]培養(yǎng)，培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高壓滅菌后使用[17]。挑取單菌落于100 mL BPY培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)10 h 達(dá)到對(duì)數(shù)穩(wěn)定期(菌落數(shù)為1×108～9×108CFU/mL)，停止培養(yǎng)。另外，于BPY培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉，以用于平板計(jì)數(shù)檢測(cè)其可培養(yǎng)數(shù)。

1.2 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀：ABI 7900 HT型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

電子自旋共振波譜儀：EMXplus-10/12型，德國(guó)布魯克科技有限公司；

激光共聚焦熒光顯微鏡：LSM710型，德國(guó)蔡司公司；

掃描電鏡：Hitachi Model SU8010型，日本JEOL公司；

透射電鏡：JEM-1230型，日本JEOL公司。

DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

細(xì)菌RNA提取試劑：杭州博日公司；

LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒：美國(guó)Molecular Probes公司；

DMPO自由基捕獲劑：>97.0%，日本TCI公司；

食品級(jí)過(guò)氧化氫：30%，上海哈勃化學(xué)技術(shù)有限公司；

過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 過(guò)氧化氫處理 取10 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠傷寒沙門氏菌于90 mL滅菌BPY培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度為1×107～9×107CFU/mL?；靹蚝蠓殖?0 mL/份稀釋菌液于15 mL離心管中，在4 ℃下5 500 r/min離心10 min，棄上清，用無(wú)菌生理鹽水洗菌體兩次，加入等體積的無(wú)菌自來(lái)水重懸。向其中加入一定體積30 g/100 g食品級(jí)過(guò)氧化氫溶液，使其終濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0，15.0，1 000，10 000 mmol/L，37 ℃暗反應(yīng)1.5 h 后4 ℃下5 500 r/min離心10 min，再用無(wú)菌自來(lái)水重懸，此步驟重復(fù)3次以去除體系中的過(guò)氧化氫終止反應(yīng)，處理后的樣品進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.2 鼠傷寒沙門氏菌總菌數(shù)、活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)定量檢測(cè)方法

(1)DNA和RNA的提?。喊凑赵噭┖胁襟E分別提取細(xì)菌DNA和 RNA。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara,Kusatsu,Japan)去除RNA中DNA的干擾，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩NA作為qPCR的模板，cDNA作為RT-qPCR的模板。

(2)qPCR引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件：以沙門氏菌保守序列invA基因[18]設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。前引物：5′-ACAGTGCTCGTTTACGACC-3′；后引物：5′-ACTGGTACTGATCGATAAT-3′，擴(kuò)增片段大小為240 bp。根據(jù)Liao等[19]的方法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。試驗(yàn)結(jié)果用ABI 7900 HT軟件進(jìn)行分析。

(3)總菌數(shù)、活菌數(shù)、可培養(yǎng)數(shù)和VBNC數(shù)的檢測(cè)：采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。將qPCR和RT-qPCR獲得的CT值與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品的CT值代入線性方程分別計(jì)算總菌數(shù)和活菌數(shù)。用平板計(jì)數(shù)測(cè)定可培養(yǎng)數(shù)。

參考Jiang等[11]的方法計(jì)算鼠傷寒沙門氏菌的VBNC細(xì)胞數(shù)和VBNC發(fā)生系數(shù)：

a=b-c，

(1)

式中：

a——VBNC細(xì)胞數(shù)，CFU/mL；

b——活細(xì)胞數(shù)，CFU/mL；

c——可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)，CFU/mL。

(2)

式中：

d——VBNC發(fā)生系數(shù)。

1.3.3 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu) 將對(duì)照和過(guò)氧化氫(15 mmol/L)處理的樣品在4 ℃ 下5 500 r/min 離心10 min后收集細(xì)菌沉淀物。用0.85% 無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀，并在4 ℃下5 500 r/min 離心10 min，此過(guò)程重復(fù)3次。將洗過(guò)的樣品用2.5% 戊二醛重懸，4 ℃過(guò)夜固定。根據(jù)Ding等[20]的方法進(jìn)行掃描和透射電子顯微鏡分析。

1.3.4 酶活性檢測(cè) 將過(guò)氧化氫(15 mmol/L)處理后的樣品分為兩份：一份直接測(cè)自來(lái)水過(guò)氧化氫處理液中的酶活，視為胞外酶活；另一份做如下處理以測(cè)其胞內(nèi)酶活：菌液于4 ℃下5 500 r/min離心10 min，棄上清，用無(wú)菌生理鹽水清洗兩次，清洗后的細(xì)胞重懸并在冰浴條件下超聲(304 W，超聲9 s，停歇30 s，重復(fù)5次)，鏡檢以確保細(xì)胞完全破碎。將超聲破碎后細(xì)菌破碎液于4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清液。參照Lin等[21]和Li等[22]的方法檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)外過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶和總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。

1.3.5 自由基強(qiáng)度檢測(cè)和圖譜分析 為了定量過(guò)氧化氫處理中自來(lái)水中產(chǎn)生的自由基，在樣品處理前加入 100 mmol/L DMPO自由基捕獲劑，處理后用電子自旋共振法(Electron Spin Resonance，ESR)檢測(cè)并分析自由基。根據(jù)Liao等[17]的方法進(jìn)行自由基強(qiáng)度和圖譜分析。使用Bruker Xenon軟件進(jìn)行自由基擬合，并以羥基自由基第2條譜線的峰高代表自由基強(qiáng)度以相對(duì)定量。

1.3.6 細(xì)菌細(xì)胞膜完整性分析 LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒包含兩種核酸熒光染料SYTO 9和PI。其中SYTO 9可以透過(guò)破損和完整的細(xì)胞膜并與DNA結(jié)合，在488 nm激發(fā)光下呈綠色熒光；而PI只能透過(guò)受損的細(xì)胞膜并與SYTO 9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，在488 nm激發(fā)光下產(chǎn)生紅色熒光。因此在兩種染料都存在的情況下，細(xì)胞膜受損的細(xì)胞呈紅色熒光，有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞呈綠色熒光。根據(jù)Liao等[19]的方法對(duì)過(guò)氧化氫處理前后的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行染色，然后使用激光共聚焦顯微鏡拍照并分析過(guò)氧化氫對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞膜完整性和活性的影響。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)至少3次重復(fù)，2個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果取平均值，并用Microsoft Excel 2013計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS Statistics V17.0 軟件(美國(guó)SPSS公司)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，用Origin 8.5軟件(美國(guó)Microcal軟件公司)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的影響

過(guò)氧化氫處理濃度對(duì)鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的影響如圖1(a)所示。未經(jīng)過(guò)氧化氫處理的鼠傷寒沙門氏菌(對(duì)照組，CK)的活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)未顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度在0.2～3.0 mmol/L時(shí)，隨著過(guò)氧化氫濃度升高，活菌數(shù)逐漸減小至4.67 lg CFU/mL；可培養(yǎng)數(shù)也逐步且迅速降低，但活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)存在顯著差異(P<0.05)；說(shuō)明其中部分鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。當(dāng)過(guò)氧化氫為5.0～15.0 mmol/L時(shí)，可培養(yǎng)數(shù)降低至平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)限(<0.1 CFU/mL)，而活菌數(shù)為4.03～4.16 lg(CFU/mL)；說(shuō)明該濃度范圍內(nèi)自來(lái)水中鼠傷寒沙門氏菌全部以VBNC存活；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度增大至1.0～10.0 mol/L，活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)均在檢測(cè)限以下，說(shuō)明自來(lái)水中鼠傷寒沙門氏菌全部被殺滅。如圖1(b)所示，即在較低濃度范圍內(nèi)(0.2～15.0 mmol/L)隨著過(guò)氧化氫濃度的升高，VBNC發(fā)生系數(shù)增大。

以上研究結(jié)果說(shuō)明低濃度過(guò)氧化氫處理可能會(huì)導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC態(tài)，且隨過(guò)氧化氫濃度增大VBNC態(tài)發(fā)生系數(shù)增大。Morishige等[16]的研究結(jié)果顯示10 mmol/L的過(guò)氧化氫處理45 min才能使肉湯培養(yǎng)基體系中腸炎沙門氏菌完全喪失可培養(yǎng)性；而Kong等[23]報(bào)道2 mmol/L的過(guò)氧化氫在室溫下處理45 min對(duì)野生型創(chuàng)傷弧菌的可培養(yǎng)性無(wú)影響；這可能是菌種、體系和處理時(shí)間的不同導(dǎo)致沙門氏菌對(duì)過(guò)氧化氫的抗性有差異。但當(dāng)其濃度增大到一定程度時(shí)，細(xì)菌無(wú)法抗衡較高濃度過(guò)氧化氫造成的損傷而全部被殺滅。

*** 表示差異顯著(P<0.05);NS 表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)
圖1 過(guò)氧化氫處理對(duì)S.Typhimurium總菌數(shù)、活菌數(shù)、可培養(yǎng)數(shù)和VBNC發(fā)生系數(shù)的影響
Figure 1 Effect on total,viable,culturable numbers and VBNC incidence index ofS.Typhimurium by hydrogen peroxidetreatment

2.2 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的影響機(jī)制

2.2.1 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響 如圖2 所示，未處理的細(xì)胞表面光滑且飽滿，大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀[圖2(a)]；而經(jīng)過(guò)氧化氫處理的大部分細(xì)胞表面褶皺塌陷甚至破裂，細(xì)胞收縮彎曲變小，少數(shù)細(xì)胞表面光滑且形態(tài)接近圓棒狀[圖2(b)]。透射電鏡觀察到未處理的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞質(zhì)分布均勻，胞內(nèi)物質(zhì)完整[圖2(c)]；而經(jīng)過(guò)氧化氫處理的大部分細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)受到嚴(yán)重的損傷，主要表現(xiàn)在胞內(nèi)物質(zhì)聚集、外漏甚至變成“空殼”。但仍有極少數(shù)細(xì)胞質(zhì)均勻分布，未受任何損傷，結(jié)合掃描電鏡觀察的結(jié)果可判斷該部分細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)過(guò)氧化氫的脅迫而進(jìn)入VBNC休眠狀態(tài)，已有報(bào)道[24]表明VBNC狀態(tài)的細(xì)胞通常表現(xiàn)出矮化(細(xì)胞尺寸減小)現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榍蛐?，?xì)胞膜完整。

圖2 過(guò)氧化氫處理對(duì)S.Typhimurium的外部形態(tài)(SEM，10 000×)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)(TEM，20 000×)的影響
Figure 2 Effect on the external morphology (SEM,10 000×)and internal structure (TEM,20 000×)ofS.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment

如圖3所示，未經(jīng)處理的鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)CAT、SOD、GPx活性較高，經(jīng)過(guò)氧化氫處理進(jìn)入VBNC狀態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)CAT活性顯著降低，幾乎為零，與Kong等[23]報(bào)道的過(guò)氧化氫酶活性喪失使細(xì)胞變得不可培養(yǎng)以及Harris等[31]研究表明幽門螺桿菌的過(guò)氧化氫酶缺陷型突變體對(duì)過(guò)氧化氫敏感而野生型可以抵抗100 mmol/L 過(guò)氧化氫結(jié)果具有一致性。除CAT活性降低外，與細(xì)胞抗氧化相關(guān)的SOD和GPx活性也顯著降低，表明經(jīng)過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞代謝活性顯著降低。

過(guò)氧化氫處理?xiàng)l件：15 mmol/L，37 ℃ 暗反應(yīng)1.5 h圖3 過(guò)氧化氫處理對(duì)S.Typhimurium酶活性的影響Figure 3 Effect on the enzyme activities of S.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment

2.2.3 過(guò)氧化氫處理中產(chǎn)生自由基對(duì)鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的干預(yù) 由于過(guò)氧化氫的殺菌因子并非其本身，而主要是其分解后產(chǎn)生的自由基和活性衍生物[32]，因此本研究測(cè)定了15 mmol/L過(guò)氧化氫處理鼠傷寒沙門氏菌90 min 內(nèi)產(chǎn)生的自由基。在0～30 min內(nèi)，隨著過(guò)氧化氫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)逐漸減小，30 min 時(shí)活菌數(shù)降至4.16 lg(CFU/mL)，可培養(yǎng)數(shù)低于平板計(jì)數(shù)的檢測(cè)限(<0.1 CFU/mL)[圖4(a)]；相應(yīng)自由基強(qiáng)度和VBNC發(fā)生系數(shù)隨著過(guò)氧化氫處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大，30 min時(shí)VBNC發(fā)生系數(shù)達(dá)到最大值[圖4(b)]；產(chǎn)生自由基圖譜的峰高也逐漸增加[圖4(c)]。然而，30～90 min內(nèi)，無(wú)論過(guò)氧化氫處理時(shí)間持續(xù)多久，活菌數(shù)基本保持不變，可培養(yǎng)數(shù)均在平板計(jì)數(shù)的檢測(cè)限以下，說(shuō)明殘留活菌全部以VBNC狀態(tài)存在。

過(guò)氧化氫處理?xiàng)l件：15 mmol/L，37 ℃ 暗反應(yīng)1.5 h

圖4 過(guò)氧化氫處理時(shí)間對(duì)S.Typhimurium總菌數(shù)、活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)、自由基強(qiáng)度和VBNC發(fā)生系數(shù)以及ESR自由基圖譜的影響
Figure 4 Effect of hydrogen peroxide treatment on total,viable,culturable numbers ofS.Typhimurium,intensity of free radicals and VBNC incidence indexes and ESR spectra of free radicals at different times

隨著過(guò)氧化氫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基強(qiáng)度卻有所下降，可能有3種原因：① 過(guò)氧化氫在光照下會(huì)有少量分解為O2和H2O[33]；② 自由基非?；顫姡嬖趬勖浅６蹋唤?jīng)產(chǎn)生就會(huì)馬上與接觸物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，而自由基與DMPO的自旋加合物存在時(shí)間也僅僅只有幾分鐘或幾十分鐘[34]；③ 體系中捕捉劑DMPO加入量不夠，已經(jīng)完全與處理過(guò)程中產(chǎn)生的自由基加合。此外，過(guò)氧化氫處理時(shí)間延長(zhǎng)并未引起活菌數(shù)、可培養(yǎng)數(shù)和VBNC發(fā)生指數(shù)的變化，表明低濃度過(guò)氧化氫誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)在短時(shí)間內(nèi)是不可逆的過(guò)程。

2.2.4 自由基參與誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌VBNC 狀態(tài)形成的驗(yàn)證 試驗(yàn)結(jié)果表明，加入100 mmol/L的丙酮酸鈉自由基清除劑后鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)均增加[圖5(a)]；VBNC發(fā)生系數(shù)降低[圖5(b)]；過(guò)氧化氫處理的自來(lái)水體系中除產(chǎn)生高強(qiáng)度的羥基自由基外，還產(chǎn)生了低強(qiáng)度的氫質(zhì)子自由基和烷基自由基[圖6(a)]，但是由于0.5 mmol/L過(guò)氧化氫濃度低，產(chǎn)生的自由基強(qiáng)度不高，因而只能觀察到羥基自由基的存在[圖6(b)]，自由基ESR圖譜表明加入丙酮酸鈉后其峰值降低。進(jìn)而通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察可看到加入丙酮酸鈉后綠色熒光細(xì)胞數(shù)增多，說(shuō)明細(xì)菌活性被保護(hù)(圖7)；而在過(guò)氧化氫處理后再加入自由基清除劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞無(wú)保護(hù)作用；從而進(jìn)一步驗(yàn)證了過(guò)氧化氫處理中自由基參與鼠傷寒沙門氏菌VBNC 狀態(tài)的形成。

圖5 H2O2處理時(shí)加(“+”)丙酮酸鈉和不加(“-”)丙酮酸鈉對(duì)S.Typhimurium的總菌數(shù)、活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)以及VBNC發(fā)生系數(shù)的影響
Figure 5 Effect on total,viable,culturable numbers and VBNC incidence indexes ofS.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

圖6 H2O2處理時(shí)加(“+”)丙酮酸鈉和不加(“-”)丙酮酸鈉對(duì)ESR自由基譜圖的影響
Figure 6 Effect on ESR spectra of free radicals by hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

圖7 H2O2處理前加丙酮酸鈉和處理后加丙酮酸鈉對(duì)S.Typhimurium活性的影響
Figure 7 Effect on the activity ofS.Typhimurium before hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了食品級(jí)過(guò)氧化氫對(duì)自來(lái)水中鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養(yǎng)性的影響，并從細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)、酶活力、自由基產(chǎn)生等幾個(gè)方面解析過(guò)氧化氫處理中VBNC狀態(tài)發(fā)生機(jī)制。結(jié)果表明，不適當(dāng)過(guò)氧化氫處理，例如0.2～15.0 mmol/L過(guò)氧化氫處理1.5 h，不僅不能達(dá)到完全殺菌的效果，反而使得其中部分鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC特殊休眠狀態(tài)而存活，進(jìn)而造成漏檢。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度到達(dá)1 mol/L 及以上，可實(shí)現(xiàn)完全滅菌。過(guò)氧化氫處理過(guò)程中產(chǎn)生羥基、烷基和氫質(zhì)子3種自由基，這些自由基的產(chǎn)生是使細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的重要原因。進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞中與氧化相關(guān)的CAT、SOD和GPx 3種酶酶活顯著降低，初步表明VBNC狀態(tài)發(fā)生與其氧化損傷可能相關(guān)。但自由基如何參與VBNC狀態(tài)形成及該狀態(tài)的細(xì)菌是否復(fù)蘇尚不明確，可進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究。