王佳茜，王少平，劉萬卉

(1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東 264000； 2.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 264000； 3.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 264000)

地龍為巨蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E Perrier)、通俗環(huán)毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen 的干燥體，前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1-4]，具有清熱定驚，通絡(luò)，平喘，利尿的功效。用于高熱神昏，驚癇抽搐，關(guān)節(jié)痹痛，肢體麻木，半身不遂，肺熱喘咳，尿少水腫，高血壓等病癥[5-8]。

地龍中的主要成分為蛋白質(zhì)，其含量占總蟲體的50%。地龍多為口服給藥，其中的蛋白質(zhì)無法直接消化進入人體，需要進行體內(nèi)酶解成小分子多肽才能被人體吸收并發(fā)揮作用[9-12]。因此本試驗?zāi)M人體消化原理對地龍進行酶解得到地龍酶解液，同時采用多種方法對地龍酶解液進行分離，得到活性強、純度高的組分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BPH-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，HH-601超級恒溫水浴鍋(鎮(zhèn)江瑞祥儀器有限公司)，MS104型十萬分一天平、MS105DU萬分之一天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)，KQ2200DV型超聲振蕩儀(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)，DKH-43型實驗室用膜處理設(shè)備(上海陶氏膜處理集團)、LG1100型蠕動泵(dragonlab儀器公司)，DA201-C、D101、AB-8大孔吸附樹脂(滄州寶恩樹脂有限公司)、sephadex G15、sephadex G25、G50、Agilent BOZAX300SB-C18肽色譜柱(150 mm，5 μm)、C18半制備色譜柱(250 mm×50 mm，10 μm)，以上色譜柱購自濟南華哲實驗儀器有限公司，TSK-GEL G2000SWXL凝膠色譜柱(300 mm，5 μm，125 ?)、RP-kromasilo C18色譜柱，以上色譜柱購自日本TSK公司，1 000 Da納濾膜、3 000 Da超濾膜、燒杯(規(guī)格：10、100、1 000和5 000 ml)，量筒(規(guī)格：10 和100 ml)，培養(yǎng)皿(直徑10 cm)，試管(0.5 cm×10 cm)，玻璃棒。

1.2試劑 凝血酶(批號20150610，活力：500 U/g，深圳生化制劑廠)，瓊脂糖(批號20151102，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，牛血纖維蛋白原(純度95.3%，批號20140103，沈陽拜英生物科技有限公司)，牛血清白蛋白BSA(純度：99.9%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，注射用尿激酶(活性：30萬U/g，遼寧天正生物制藥有限公司)，生理鹽水(500 ml，山東華魯制藥集團)，分子量測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(BSA66430、血管緊張素1 045.5、低分子肝素鈉3 700、乙酰胺乙酰胺乙酸189.1)購自上海源葉生物科技有限公司,磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銅、硫酸鋰、鎢酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸、鉬酸鈉、鹽酸均為分析純，去離子水(實驗室自制，密理博水處理系統(tǒng))。

2 方法與結(jié)果

2.1纖維平板纖溶試驗

2.1.1試劑配制

2.1.1.1磷酸(PBS)緩沖溶液制備 稱取磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉適量，加入適量去離子水，制成pH為7.2的磷酸緩沖溶液。

2.1.1.2工作液 將生理鹽水和配好的PBS溶液按照17∶1的比例配制工作液。

2.1.1.3牛纖維蛋白原溶液 取0.3 g牛纖維蛋白原，加工作液100 ml，配制成0.3%的牛纖維蛋白原溶液。

2.1.1.4凝血酶溶液 取凝血酶1.0 g，加生理鹽水制成10 U/ml的溶液。

2.1.1.5尿激酶溶液 取30萬U/g的尿激酶，加生理鹽水，分別配制成100 000、50 000、10 000、1 000、500和100 U/ml的溶液。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 取工作液100 ml，采用電熱套對其加熱煮沸，加入0.5 g瓊脂糖，待其徹底溶解后，取出，放涼至50 ℃，加入20 ml牛纖維蛋白原溶液、1.0 ml 10 U/ml凝血酶溶液，振蕩后導(dǎo)入培養(yǎng)皿內(nèi)部，每個培養(yǎng)皿10 ml，放入4 ℃冰箱冷藏15 min。用直徑為1 mm打孔器進行打孔，并在每個孔內(nèi)加入“2.1.1.5”項下各尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h(37 ℃)。取出后采用游標(biāo)卡尺對溶圈進行測定，計算溶圈面積。以溶圈面積為縱坐標(biāo)，以尿激酶活力(U)的對數(shù)為橫坐標(biāo)進行線性回歸。 得到線性方程為Y=1.560 2X-1.833 1(R2=0.996 4)，結(jié)果尿激酶活性在100～50 000 U范圍內(nèi)線性良好。

2.2多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1對照品溶液 精密稱取牛血清白蛋白10 mg，加去離子水溶解，而后轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中定容，備用。

2.2.2堿性銅試液配制 精密稱取烘干后的NaOH 10.0 g、Na2CO350 g，加水400 ml溶液，作為A液；再取酒石酸鉀鈉0.5 g、五水硫酸銅0.25 g，加水80 ml溶解，作為B液。使用時A液、B液混合定容至500 ml即得堿性銅試液。

2.2.3福林酚試液配制 取鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)50 g、鉬酸鈉12.5 g，加水500 ml置于2 000 ml圓底燒瓶內(nèi)，再加入35%磷酸溶液25 ml、鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.5%)50 ml，然后置于加熱套內(nèi)冷水回流加熱，沸騰后計時，保持微沸10 h，再加硫酸鋰25 g、去離子水50 ml，搖勻，再加0.2 ml溴，敞口加熱揮發(fā)多余的溴，保持沸騰15 min，放涼，倒出，過濾，置于棕色量瓶內(nèi)，定容至500 ml，備用。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0 ml，再分別加入堿性銅試液1.0 ml，搖勻，各加入福林酚試液[取福林試液儲備液(1→16)]4.0 ml，立即混勻，置55 ℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅴ A)，以0號管為空白，在650 nm波長處迅速測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性回歸方程。線性回歸方程為Y=2.028 3X+0.008 6(R2=0.999 1)，表明肽在0～0.2 mg/ml范圍內(nèi)線性良好。

2.3樣品制備與處理

2.3.1酶解液制備 取地龍藥材(粉粹、過80目篩)100 g，加去離子水1 000 ml，先加熱煎煮20 min，然后加0.1 mol/ml HCl溶液調(diào)pH至1.5，再加入胃蛋白酶1.0 g，37 ℃保溫酶解1.0 h，而后再加2%NaOH溶液調(diào)pH至8.0，加胰蛋白酶1.0 g，繼續(xù)酶解2.0 h，酶解完成后煮沸20 min，放涼，冷藏12 h，離心(4 500 r/min) 10 min，收集離心液，濃縮至500 ml。

2.3.2酶解液脫鹽處理 調(diào)整地龍酶解液濃度到500 mg/ml，調(diào)pH至6.5，分別裝入電滲析儀器內(nèi)，先在流速15 L/h下平衡裝置15 min，連通電源，在電壓31 V條件下進行除鹽操作，操作時間為150 min。采用電導(dǎo)儀進行測定得出脫鹽率為95%。

2.4地龍活性肽分離

2.4.1超濾分離 采用3 000 Da、1 500 Da超濾膜對“2.3.2”項下的地龍酶解脫鹽液進行超濾處理，設(shè)定壓力為0.3 Mpa，流速為20 L/h，同時采用恒容間歇方法進行試驗，將地龍酶解脫鹽液分為<1 500 Da、1 500～3 000 Da和>3 000 Da 3種溶液。分別標(biāo)記為L1、L2和L3。調(diào)整L1、L2、L3溶液質(zhì)量濃度至5 mg/ml，采用“2.1”項下纖溶試驗對3種溶液進行活性測定，得出體外纖溶活性結(jié)果，見表1。結(jié)果表明，體外纖溶活性大小順序為L1>L2>L3。因此選用L1即<1 500 Da溶液進行下一步分離。

表1 超濾溶液活性結(jié)果(n=5)

2.4.2DA201-C樹脂分離

2.4.2.1DA201-C樹脂預(yù)處理 取DA201-C樹脂適量，先加去離子水，充分浸泡12 h，過濾，反復(fù)幾次，直至溶液無顏色變化為止。然后加95%乙醇浸泡12 h，過濾，反復(fù)幾次，直至乙醇溶液無顏色變化為止，再使用去離子水沖洗至無醇味，備用。

2.4.2.2樹脂吸附 將與處理好的DA201-C樹脂裝入樹脂柱，然后將地龍酶解液<1 500 Da溶液調(diào)整濃度至20 mg/ml，調(diào)節(jié)pH至6.0，以2 BV/h的流速上樣，下端接電腦自動收集器，每5 ml收集一試管，以A220 nm≤0.05為上樣終點，靜態(tài)吸附3 h后，采用去離子水、30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇分別對吸附后的DA201-C樹脂進行洗脫。分別收集洗脫液，濃縮，調(diào)整質(zhì)量濃度至5 mg/ml。

2.4.2.3活性測定 采用“2.1”項下纖溶試驗對4種洗脫溶液進行活性測定，得出體外纖溶活性結(jié)果。見表2。結(jié)果表明，30%乙醇洗脫液洗脫液纖溶活性最強，因此下一步對30%乙醇洗脫液進行分離。

2.4.3G15凝膠分離

2.4.3.1G15 sephadex凝膠預(yù)處理 取G15凝膠樹脂，采用去離子水洗滌，過濾，去掉雜質(zhì)后，再次采用去離子水充分浸泡24 h，備用。

表2 DA201-C樹脂洗脫液活性結(jié)果(n=5)

2.4.3.2G15凝膠樹脂分離 取G15凝膠樹脂，裝入樹脂柱內(nèi)，將過DA201-C樹脂的30%乙醇洗脫液濃縮至10 mg/ml，從樹脂柱上端裝入，上樣體積2 ml，上樣后隨即采用去離子水進行洗脫。下端接樣品電腦自動收集器，每1 ml收集一個試管，在280 nm下檢測每個試管的吸光度并記錄，繪制以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，試管吸光度為縱坐標(biāo)的曲線。結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，G15將30%乙醇洗脫液分為兩個部分，第一部分為試管7～14，第二部分為試管15～30，因此重復(fù)上述分離步驟50次，分別收集兩個峰，分別命名為P1和P2。調(diào)整質(zhì)量濃度為5 mg/ml，然后按照“2.1”項下纖溶試驗對P1、P2進行活性測定，得出體外纖溶活性結(jié)果，見表3。

試管數(shù)圖1 G15吸附結(jié)果圖表3 G15分離樣品活性結(jié)果

樣品活性(U/g)P15 002.134 8±89.003 4P223 485.290 1±154.394 5

表3結(jié)果得出，G15分離得到的P1、P2活性大小為P2>P1，因此下一步對P2進行分離。

2.4.4液相分離 地龍酶解液采用超濾、DA201-C樹脂、G15凝膠分離后得到活性較高的P2組分，為進一步了解P2起纖溶活性的物質(zhì)，采用液相對P2組分進行進一步分離。

色譜條件：色譜柱：waters -C18肽色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：220 nm；流速：1.0 ml/min；檢測器：UV檢測器；流動相：采用梯度洗脫方法：A:0.1%TFA乙腈，B：0.1%TFA水，0～55 min：95%B→50%B；55 min～75 min：50%B→95%B；進樣量：20 μl。按照以上色譜條件進行試驗。結(jié)果見圖2。

圖2 色譜對P2組分的分離結(jié)果

根據(jù)圖2所示，液相將P2組分分為5個主要峰，分別命名為F1、F2、F3、F4和F5，說明分離效果良好。因此按照上述液相條件采用半制備液相對組分P2進行半制備分離，分離得到F1、F2、F3、F4和F5樣品，濃縮至質(zhì)量濃度為2 mg/ml。并按照“2.1”項下體外纖溶活性試驗對5個樣品進行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果5個組分的活性順序為F3>F2>F1>F5>F4，說明F3組分為主要的活性成分。

采用Waters半制備液相對P2樣品進行半制備，重復(fù)100次，接收F3組分，采用“2.1”、“2.2”項下方法對F3組分進行多肽含量、纖溶活性試驗，得出多肽含量為95.13%，纖溶活性為60 021.302 9 U/g。

表4 5個組分活性結(jié)果

3 討論

本試驗以地龍為試驗材料，結(jié)合人體對大分子蛋白的消化原理設(shè)計體外酶解方法對地龍藥材進行體外酶解，得到地龍活性酶解液。同時采用電滲析、超濾、DA201-C樹脂、saphedexG15凝膠樹脂、液相進行分離，得到純度高、活性強的組分F3。同時采用Waters半制備液相對F3進行半制備，然后對F3進行多肽含量與活性測定，得出F3多肽含量為95.13%，纖溶活性為60 021.302 9 U/g。

地龍作為傳統(tǒng)中藥具有活血化瘀的功效，現(xiàn)代研究得出，地龍中的活性成分為蚓激酶，蚓激酶為兩種類型酶，即纖維蛋白溶酶原激活物和纖維蛋白溶酶；其中還有類似組織型纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)的成分。但是大分子蛋白并不能直接通過腸道被人體吸收，因此酶解后形成小分子肽才能更好地發(fā)揮藥效作用。由于酶的位切點存在多樣化，因此造成酶解多肽存在多個序列形成混合物。因此試驗采用多種方法在多肽混合物中尋找活性較強的組分。后期試驗將對F3采用LC-TOF2-MS、500 M核磁共振儀進行結(jié)構(gòu)的分析。