趙寧?侯成成?章鵬?于仲濤?楊東星?盧偉偉?沈愛娟?劉鐵?田俊閣?于笑霞

【摘要】目的 研究核苷酸結合寡聚化結構域1（NOD1）和NOD2在類風濕關節(jié)炎（RA）患者外周血中的表達水平，初步探討NOD1和NOD2在RA疾病中的作用。方法 采集40例RA患者（RA組）、40例骨關節(jié)炎（OA）患者（OA組）及40名健康志愿者（對照組）的外周血標本，分離外周血單個核細胞（PBMC），使用熒光定量PCR（qPCR）檢測3組PBMC中NOD1和NOD2 mRNA水平。隨機抽取10例RA患者、10例OA患者及10名健康志愿者的PBMC加入胎牛血清培養(yǎng)，并加入胞壁酰二肽（MDP）培養(yǎng)24 h，ELISA法檢測3組上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平。結果 3組PBMC中NOD2 mRNA的表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.001），其中RA組PBMC中NOD2 mRNA表達水平高于其他2組（P均< 0.001），而3組PBMC中NOD1 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。MDP作用于3組PBMC后，RA組的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于另外2組（P均< 0.05），而OA組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05）。結論 RA患者的NOD2 mRNA表達水平較高。NOD2激活可能誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子釋放。NOD2可能參與了RA的發(fā)病過程。

【關鍵詞】類風濕關節(jié)炎;核苷酸結合寡聚化結構域;外周血單核細胞;促炎因子

Expression of NOD-like receptors in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis Zhao Ning， Hou Chengcheng， Zhang Peng， Yu Zhongtao， Yang Dongxing， Lu Weiwei， Shen Aijuan， Liu Tie， Tian

Junge， Yu Xiaoxia. Department of Rheumatology and Immunology， Hebei Province Cangzhou Hospital of Integ-rated Traditional and Western Medicine， Cangzhou 061000， China

Corresponding author， Hou Chengcheng， E-mail： m15055308511@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the expression levels of nucleotide-binding oligomerization domain 1 （NOD1） and nucleotide-binding oligomerization domain 2 （NOD2） mRNA in the peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis （RA）， aiming to explore the roles of NOD1 and NOD2 in RA disease. Methods The expression levels of NOD1 and NOD2 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of 40 patients with RA， 40 osteoarthritis （OA） and 40 healthy volunteers were detected by real-time PCR （qPCR）. PBMCs randomly selected from 10 RA， 10 OA patients and 10 healthy volunteers were supplemented with fetal bovine serum and stimulated by muramyl dipeptide （MDP） for 24 h. The levels of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α in the supernatant were detected by ELISA.? Results The expression levels of NOD2 mRNA in PBMCs of significantly differed among three groups （all P < 0.001）. The NOD2 mRNA level in the RA group was significantly higher than those in the other two groups （both P < 0.001）. However， there was no significant difference in the expression of NOD1 mRNA among three groups （P > 0.05）. After adding MDP to the PBMCs， the expression levels of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α in the supernatant of PBMCs of RA patients were significantly higher than those in the other two groups （all P < 0.05）， whereas there was no significant difference between the OA and the healthy volunteer groups （all P > 0.05）.? Conclusions The expression level of NOD2 mRNA in PBMCs of RA patients is higher than those of OA patients and healthy volunteers. The activation of NOD2 can induce the release of pro-inflammatory factors， such as IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α， suggesting that NOD2 may be involved in the pathogenesis of RA.

【Key words】Rheumatoid arthritis;Nucleotide-binding oligomerization domain;

Peripheral blood mononuclear cell;Pro-inflammatory cytokine

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種慢性、全身性自身免疫性疾病，以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現。雖然RA的確切發(fā)病機制尚未明確，但既往研究顯示固有免疫的激活在該病的發(fā)病中起著重要作用[1]。固有免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原微生物和內在損傷組織入侵的第一道防線，模式識別受體（PRR）是固有免疫系統(tǒng)中的重要成員，其可以識別病原相關分子模式（PAMP）和損害相關分子模式（DAMP）產生相應的對抗病原微生物及損害分子的固有免疫反應。 PRR主要包括Toll樣受體（TLR）和細胞內核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）蛋白家族中的NOD樣受體（NLRs）。NOD1和NOD2是NLR中最為重要且研究較多的受體[2-3]。既往研究顯示，NOD1和NOD2激活后可導致多條信號通路的激活（包括NF-κB及MAPK通路），進而釋放多種促炎因子，參與自噬過程;此外其還與TLR有交叉協(xié)同作用[4]。近年有研究探討了NOD1和NOD2在RA患者的滑膜組織及成纖維樣滑膜細胞（FLS）中的表達，發(fā)現其可激活MAPK信號通路，并進一步促進促炎因子的釋放[5]。Vieira（2012年）進行的動物實驗發(fā)現NOD2可能參與了RA的炎癥機制，其信號通路可能引發(fā)了局部關節(jié)的免疫炎癥反應[8]。本研究旨在初步探討NOD1、NOD2在RA患者的外周血單核細胞（PBMC）中的表達水平及其可能發(fā)揮的功能，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選擇2018年6月至12月在我院住院的40例RA初治患者（RA組）、40例骨關節(jié)炎（OA）初治患者（OA組）及40名健康志愿者（對照組）。RA組納入標準：①年齡18 ～ 70歲;②符合 1987年或2010年美國風濕病學會（ACR）的RA診斷分類標準;③患者的28處關節(jié)疾病活動度評估（DAS28）? ≥4.0。OA組納入標準：①年齡18 ～ 70歲;②符合2007年版的OA診治指南相關標準。對照組納入標準：年齡18 ～ 70歲，無風濕性疾病或相關家族史。2組的排除標準：①處于妊娠、分娩及哺乳期的女性患者;②合并嚴重感染者;③合并惡性腫瘤者;④合并其他自身免疫性疾病;⑤入組前曾使用改善病情抗風濕藥（DMARD）、生物制劑及糖皮質激素治療。所有入選者均已簽署知情同意書，研究方案的設計及實施均符合相關倫理要求。

二、方 法

1. PBMC的分離及培養(yǎng)

采集入選對象晨起空腹外周血8 ml置于肝素鈉抗凝管，輕輕混勻，將混合后的血樣取4 ml貼著管壁緩慢轉移至已加入4 ml淋巴細胞分離液的離心管內，注意保持液面平整;調整離心機溫度24℃，以4000轉/分離心10 min。吸取離心管中間層云霧狀液體轉移至已事先加入4 ml生理鹽水的離心管內，調整離心機溫度24℃，以4000轉/分離心5 min;棄上清液，加生理鹽水4 ml再次相同條件下離心5 min。離心后棄上清液，離心管底部沉淀物即為PBMC。隨機抽取10例RA患者、10例OA患者及10名健康志愿者的PBMC置于胎牛血清培養(yǎng)，并加入胞壁酰二肽（MDP）激活NOD2。

2. NOD1和NOD2 mRNA水平檢測

采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法提取3組PBMC的總RNA，加入Trizol試劑 （Life Sciences， 美國）提取RNA。使用DNA/RNA濃度測定儀測定提取的RNA含量，當測量標本的260 nm

和280 nm光密度比值位于1.8左右時，方可進行后續(xù)實驗。根據測量結果將RNA濃度稀釋調整至約200 μg/μl，再次測量得到準確濃度后通過20 μl的反應體系（SYBR Green qPCR法）進行RNA的逆轉錄反應獲得cDNA片段。應用7500 Fast Real Time PCR System，采用20 μl的擴增體系進行Real Time PCR反應，引物序列如下：GAPDH 正向5-ATCACCATCTTCCAGGAG-3、反向5-ATGGACTGTGGTCATGAG-3， NOD1正向

5-CAGCACTTTCCCATGTATTGAT-3、反向5-T-

CAAATCCCACACTGCACA-3，NOD2正向5-GG-

TTGATGCCTGTGAACTGAA-3、反向5-AAA-TGAAATGGAACTGCCTCTT-3。反應條件：預變性95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s循環(huán)40次，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95℃ 15 s。實驗重復3次，GAPDH作為對照基因，計算目的基因NOD1、NOD2的2-△△Ct值，比較3組間差異。

3. 上清液細胞因子水平的檢測

在RPMI培養(yǎng)液中培養(yǎng)RA患者、OA患者及健康志愿者的PBMC（濃度約1×106/L），各加入MDP（InvivoGen，美國）、MDP Control（InvivoGen，美國）培養(yǎng)24 h。取其上清液，通過ELISA法檢測IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平，上述檢測試劑盒均為美國R&D公司產品。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、RA組患者的基本情況及其與OA組及對照組的性別構成、年齡比較

RA組男12例、女28例，年齡（45.4±8.7）歲，OA組男9例、女31例，年齡（47.8±5.7）歲，對照組男10例、女30例，年齡（46.6±6.8）歲，3組的性別構成、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05）。RA患者的病程為（3.2±1.4）年，DAS28為（5.2±0.8）分，RF（78.5±24.8）kU/L，抗環(huán)瓜氨酸抗體（CCP）陽性36例（90%），ESR（85.4±18.2）mm/h，CRP（73.5±25.4）mg/L。

二、RA組、OA組與對照組PBMC的NOD1、NOD2 mRNA表達水平比較

3組NOD1 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（F = 0.148，P = 0.863）。3組的NOD2 mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 245.3，P < 0.001），多重比較顯示RA組的NOD2 mRNA表達水平高于其他2組（P均< 0.001），見圖1。

三、NOD2激活后3組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較

NOD2的激活劑MDP刺激3組PBMC 24 h后，3組間的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（F分別為527.0、139.5、156.4、130.7，P均< 0.001），其中RA組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于其他2組（P均< 0.05），而OA組與對照組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見圖2。

討論

雖然有關RA確切的發(fā)病機制尚不清楚，但是既往研究表明固有免疫細胞中的PRR在其發(fā)病中起著重要作用，如單核細胞在RA的滑膜增生及促炎細胞因子產生中發(fā)揮著重要的作用。本研究初步探討了未受DMARD作用影響的RA患者與OA患者及健康志愿者的外周血PBMC中與固有免疫相關的NLR家族成員NOD1及NOD2 mRNA表達水平差異。研究顯示，RA組PBMC中NOD2 mRNA表達水平高于其他2組，而NOD1 mRNA表達水平在3組PBMC中比較差異無統(tǒng)計學意義。既往國外也有相似結論的研究，但是該項研究是在已正規(guī)治療的RA患者中進行的，并未排除服用甲氨蝶呤等DMARD的因素[5]。本研究首次探討了初治RA患者中NLR的表達，排除了藥物治療的影響因素。此外，有部分研究探討了NOD2在RA滑膜組織中的表達，發(fā)現其在RA的滑膜細胞中表達上調[5-6]。上述研究均是在組織的固有細胞進行的，而本研究是在PBMC中進行。通過體外培養(yǎng)3組PBMC，使用MDP激活NOD2后，研究顯示RA患者的PBMC釋放了大量的炎性細胞因子，其中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均比其他2組升高，OA組與對照組釋放的細胞因子水平比較差異均無統(tǒng)計學意義。該結果提示NOD2在RA的關節(jié)炎發(fā)病機制中可能發(fā)揮著某些致炎作用。近年Kim等[6]研究也顯示NOD2基因和蛋白表達水平在RA患者中表達較OA患者明顯增加，而RA患者成纖維樣滑膜細胞中NOD2基因的下調可減少促炎因子的生成，此外其下調還能降低NF-κB信號通路相關蛋白的表達水平。因此，本研究針對RA患者PBMC中NOD2的研究發(fā)現與既往有關NOD2在RA局部滑膜細胞中的研究發(fā)現相似，均提示NOD2可能在RA發(fā)病機制的固有免疫中充當著重要角色。但是，目前有關RA發(fā)病中激活NOD2的成分尚不明確，此外其在關節(jié)及外周血中具體激活通路及致病機制研究尚少，仍需日后研究進行深入探討。

綜上所述，NLRs中NOD2在RA的PBMC中表達較OA及健康志愿者升高，其激活可誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子釋放，這提示NOD2可能參與RA的發(fā)病過程，但其具體分子機制仍需進一步深入研究。

參? 考? 文? 獻

[1] Alam J， Jantan I， Bukhari SNA. Rheumatoid arthritis： recent advances on its etiology， role of cytokines and pharmacotherapy. Biomed Pharmacother，2017，92：615-633.

[2] Takeuchi O， Akira S. Pattern recognition receptors and inflam-mation. Cell，2010，140（6）：805-820.

[3] 侯成成，潘宇航，黃祥奇，李秋霞，張曦，黃紅月，金歐. NOD2在狼瘡性腎炎患者腎臟組織中的表達，新醫(yī)學，2016，47（2）：102-108.

[4] Yao Q， Su LC， Tomecki KJ， Zhou L， Jayakar B， Shen B. Dermatitis as a characteristic phenotype of a new autoinfla-mmatory disease associated with NOD2 mutations. J Am Acad Dermatol，2013，68（4）：624-631.

[5] Franca R， Vieira SM， Talbot J， Peres RS， Pinto LG， Zamboni DS， Louzada-Junior P， Cunha FQ， Cunha TM. Expression and activity of NOD1 and NOD2/RIPK2 signalling in mononuclear cells from patients with rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol，2016，45（1）：8-12.

[6] Kim HW， Kwon YJ， Park BW， Song JJ， Park YB， Park MC. Differential expressions of NOD-like receptors and their associations with inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol，2017，35（4）：630-637.

（收稿日期：2019-06-04）

（本文編輯：林燕薇）