張媛淵，王如福，郎繁繁，侯紅萍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801； 2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，太原 030400)

早在20世紀(jì)50年代就有了固定化酶技術(shù)，即用固體材料將酶束縛或限制在一定的空間內(nèi)，但其仍能進(jìn)行特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)，相比傳統(tǒng)的游離酶更有優(yōu)勢(shì)，穩(wěn)定性好，易與底物及反應(yīng)物分離，可維持酶活力等[1，2]。固定化酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、生物和化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域[3-8]。載體材料的選擇對(duì)制備固定化酶尤為重要，選擇某種惰性材料，對(duì)酸、堿、溫度等環(huán)境條件具有一定的耐受性。

山西老陳醋有顏色較深、醋液清亮、氣香醇厚等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的山西老陳醋經(jīng)過(guò)“夏日曬，冬撈冰”的方法進(jìn)行陳釀，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9～12個(gè)月，可制得老陳醋，傳統(tǒng)陳釀方法有較多的缺點(diǎn)，如：占地面積廣，不易管理，環(huán)境不佳等，所以人工催陳食醋技術(shù)備受關(guān)注，主要有物理法和化學(xué)法[9-11]。而生物酶法在醋中的應(yīng)用尚未可見(jiàn)，利用酶加速催化醋的陳化是新的研究方向。

本試驗(yàn)采用包埋法固定化紅曲酯化酶，將其應(yīng)用于食醋中，促進(jìn)酯化反應(yīng)，提高品質(zhì)。對(duì)食醋企業(yè)的發(fā)展有提升經(jīng)濟(jì)效益的作用，有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 原料和試劑

原料：山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

紅曲酯化酶(食品級(jí)，10萬(wàn)/活力單位)：武漢佳成生物制品有限公司；食品級(jí)黃原膠(XG)、食品級(jí)瓜爾豆膠(GG)、食品級(jí)卡拉膠(CG)、食品級(jí)海藻酸鈉(SA)、α-萘酚、α-乙酸萘酯、SDS、無(wú)水碳酸鈉、固藍(lán)B鹽。

1.2 儀器和設(shè)備

ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；JJ124BC型萬(wàn)分之一電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；B11-3型恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酯化酶酶液制備

稱取1 g酶粉，用pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液充分溶解，將酶液用100 mL容量瓶定容。再用定性濾紙將其過(guò)濾，得到酯化酶酶液，置于4 ℃冰箱中冷藏[12]。

1.3.2 游離酯化酶活力測(cè)定

圖1 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of α-naphthol

參考文獻(xiàn)[13，14]的方法改進(jìn)：移取 0.25 mL酯化酶液, 加入磷酸緩沖液 4.25 mL，然后加入0.25 mL 0.1 mg/mL α-乙酸萘酯溶液, 于40 ℃恒溫水浴定時(shí)反應(yīng)10 min, 然后加入 0.25 mL 3% SDS水溶液終止反應(yīng), 再加入0.25 mL 0.05%的固藍(lán)B鹽溶液顯色，混勻計(jì)時(shí) 30 s時(shí)加入 0.25 mL 6 mol/L的鹽酸溶液使顯色穩(wěn)定, 同時(shí)把酶液換成蒸餾水的溶液作空白, 用分光光度計(jì)檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。

用紫外分光光度計(jì)掃描α-萘酚以及固藍(lán)B鹽與 α-萘酚形成絡(luò)合物的吸收曲線，在525 nm處有最大吸收峰，選擇 525 nm為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。繪制α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

1.3.3 固定化酯化酶活力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的固定化酶顆粒，根據(jù)游離酯化酶活力的測(cè)定方法測(cè)定固定化酯化酶的活力。

1.3.4 相對(duì)酶活力的計(jì)算

相對(duì)酶活是按同組最高酶活為參考，計(jì)算出的酶活比值為相對(duì)酶活，設(shè)定同組最高酶活力的相對(duì)酶活，計(jì)為100%。

1.3.5 固定化酯化酶的制備

載體材料：海藻酸鈉(SA)、黃原膠(XG)、瓜爾豆膠(GG)、卡拉膠(CG)。

載體濃度：以載體溶液總體積30 mL 計(jì)，設(shè)定復(fù)合凝膠質(zhì)量濃度為0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4 g/dL，載體比例1∶1或1∶1∶1 ，稱取膠體，在 60 ℃ 以下溫水溶解，室溫下加入6 mL 酯化酶液，攪拌均勻，放入40 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)至膠體中無(wú)殘留的氣泡。 使用 10 mL無(wú)菌注射器，以約1 滴/s的速度，將凝膠滴入質(zhì)量濃度為2.4%的CaCl2溶液中，在 4 ℃ 冰箱中固化 2.0 h之后將載體顆粒濾出，再用乙酸-乙酸鈉緩沖液沖洗除去表面的CaCl2溶液。擦干載體顆粒表面的水分， 得到固定化酶顆粒，在0～4 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

在此基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法，依次考察載體比例3∶2(3∶1∶1)、2∶1(4∶1∶1)、5∶2(5∶1∶1)、3∶1(6∶1∶1)，固定化時(shí)間(1.5，2，2.5，3，3.5，4 h)、固定化液濃度(1.8%、2.4%、3%、3.6%、4.2%、4.8%)和酶液添加量(3，4，5，6，7，8 mL)測(cè)定相對(duì)酶活力。

1.3.6 固定化酯化酶條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以固定化載體濃度(X1)、固定時(shí)間(X2)、酶液添加量(X3)為影響因素，相對(duì)酶活力(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.7 固定化酯化酶操作半衰期的研究

取一定量的固定化酶測(cè)定初始酶活力，以乙酸乙酯為底物進(jìn)行反應(yīng)，做2組重復(fù)，每隔2天測(cè)定1次。假定活力損失與時(shí)間成指數(shù)關(guān)系， 半衰期用下式表達(dá)：

式中：E為反應(yīng)初始時(shí)的酶活U;Et為反應(yīng)t時(shí)刻的酶活U。

1.3.8 食醋主要理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸的測(cè)定參考GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；不揮發(fā)酸的測(cè)定參考GB/T 18187—2000《釀造食醋》；還原糖的測(cè)定參考GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》；總酯的測(cè)定參考GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》。

1.3.9 固定化酯化酶應(yīng)用于食醋

將制備好的固定化酶顆粒加入100 mL食醋中促進(jìn)其酯化反應(yīng)。固定化酯化酶的添加量為6，9，12 g；控制作用溫度分別為35，40，45 ℃；分別測(cè)定在12，24，36，48 h的總酯含量。并根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)確定加入最佳固定化酶量、作用時(shí)間及作用溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酯化酶條件的確定

2.1.1 載體的濃度對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響

載體濃度對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 載體的濃度對(duì)固定化酯化酶活力的影響Fig.2 Effect of carrier concentration on activity of immobilized esterase

由圖2可知，SA-XG-CG和SA-XG隨著載體濃度的增加，相對(duì)酶活力逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到2.1 g/dL時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到最大值，分別為99.86%和94.14%，當(dāng)濃度>2.1 g/dL時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸下降；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG隨著載體濃度的增加，相對(duì)酶活力也逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到1.8 g/dL時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到最大值，分別為88.92%、95.91%、95.48%、93.01%。故選擇SA-XG和SA-XG-CG的最佳載體濃度為2.1 g/dL；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳載體濃度為1.8 g/dL。

2.1.2 載體比例對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響

載體比例對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響見(jiàn)表2。

表2 載體比例對(duì)固定化酯化酶活力的影響Table 2 Effect of carrier ratio on activity of immobilized esterase

由表2可知，當(dāng)SA-XG、SA-CG、SA-GG、SA-XG-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的載體比例分別為3∶1、5∶2、3∶1、4∶1∶1、4∶1∶1、5∶1∶1時(shí)，相對(duì)酶活力較高，分別為74.56%、100%、82.88%、79.37%、86.17%、90.15%。因此選擇3種酶活力較高的載體組合為SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG，且比例分別為5∶2、4∶1∶1、5∶1∶1。

2.1.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響

固定化時(shí)間對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酯化酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization time on activity of immobilized esterase

由圖3可知，隨著固定化時(shí)間的增加，相對(duì)酶活力逐漸增加，SA-CG在2.5 h達(dá)到最大值94.24%，當(dāng)時(shí)間>2.5 h時(shí)，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)；SA-XG-GG與SA-CG-GG在3 h達(dá)到最大值99.56%和85.44%；當(dāng)時(shí)間>3 h時(shí)，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)。因此選擇SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化時(shí)間分別為2.5，3，3 h。

2.1.4 固化液濃度對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響

固化液濃度對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 固化液濃度對(duì)固定化酯化酶活力的影響Fig.4 Effect of solidified liquid concentration on activity of immobilized esterase

由圖4可知，隨著固定化時(shí)間的增加，相對(duì)酶活力先增加后減小，SA-CG在2.4 g/dL達(dá)到最大值99.87%，當(dāng)濃度>2.4 g/dL時(shí)，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)；SA-XG-GG與SA-CG-GG在3 g/dL達(dá)到最大值98.98%和95.78%；當(dāng)濃度>3 g/dL時(shí)，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)。因此選擇SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化濃度分別為2.4，3，3 g/dL。

2.1.5 酶液添加量對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響

酶液添加量對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶液添加量對(duì)固定化酯化酶活力的影響Fig.5 Effect of the additive amount of enzyme solution on activity of immobilized esterase

由圖5可知，隨著固定化時(shí)間的增加，相對(duì)酶活力先增加后減小，SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG在酶液添加量為7 mL達(dá)到最大值99.65%、90.96%、92.96%；當(dāng)酶添加量>7 mL時(shí)，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)；因此選擇最佳酶液添加量為7 mL。

綜合比較分析得出選擇SA-CG為最佳固定化酯化酶載體，載體比例為5∶2，載體濃度為1.8 g/dL，固定化時(shí)間為2.5 h，固化液濃度為2.4 g/dL，酶液添加量為7 mL。

2.2 固定化酯化酶響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of test

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得出：固定化酯化酶相對(duì)酶活力(Y)與載體濃度(X1)、固定化時(shí)間(X2)、酶液添加量(X3)3個(gè)因素的多元線性回歸模型方程為：Y=99.04-2.77X1+0.33X2+4.16X3-2.30X1X2-1.87X1X3+1.33X2X3-8.16X12-8.83X22-10.16X32。

由表4可知，模型的P<0.0001，差異極顯著，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠；失擬項(xiàng)P=0.0564>0.05，差異不顯著，則回歸方程的擬合程度良好，可反映3個(gè)因素與響應(yīng)值的關(guān)系；且模型回歸決定系數(shù)R2=0.9875，則響應(yīng)值的變化有98.75%來(lái)源于所選因素的變化，該模型可用來(lái)預(yù)測(cè)酯化酶固定化條件的優(yōu)化程度?；貧w方差及各項(xiàng)方差結(jié)果表明，3個(gè)因素固定化酯化酶相對(duì)酶活力的影響主次順序?yàn)閄3>X1>X2，即酶液添加量>載體濃度>固定化時(shí)間。另外，一次項(xiàng)X1和X3對(duì)Y影響極顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)X1X2對(duì)Y影響顯著(P<0.05)。

由Design-Expert 8.0.6.1得出固定化酯化酶的最優(yōu)條件：載體濃度為1.68 g/dL，固定化時(shí)間為2.56 h、酶液添加量7.23 mL，其相對(duì)酶活力達(dá)到99.81%。為了便于實(shí)際操作，將最優(yōu)工藝條件修訂為：載體濃度1.68 g/dL、固定化時(shí)間153 min、酶液添加量7.23 mL。

2.2.2 固定化酯化酶條件的響應(yīng)面分析及等高線

載體濃度、固定化時(shí)間、酶液添加量交互作用對(duì)固定化酯化酶相對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面曲線及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 載體濃度、固化時(shí)間、酶液添加量交互作用對(duì)固定化 酯化酶相對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.6 Response surface and contour map of effects of carrier concentration, immobilization time and the additive amount of enzyme solution on relative activity of immobilized esterase

由圖6可知，任何2個(gè)交互作用的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，可直觀得到各因素的最優(yōu)水平及其相互作用。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下做3次平行試驗(yàn)，得到的固定化酯化酶的相對(duì)酶活力為(99.79±0.158)%，與預(yù)測(cè)值99.81%一致，故得到的模型能夠較好預(yù)測(cè)實(shí)際固定化酯化酶的相對(duì)酶活力，具有可靠的現(xiàn)實(shí)意義。

2.3 固定化酶操作半衰期

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量固定化酶測(cè)定初始酶活力值，并準(zhǔn)確稱取等質(zhì)量的固定化酶顆粒加入食醋中進(jìn)行催陳，做2組重復(fù)，2天后取出，計(jì)算該固定化酯化酶的操作半衰期，結(jié)果為70.7 h 。

2.4 固定化酯化酶應(yīng)用于食醋的催陳作用

固定化酯化酶作用于食醋的催陳作用見(jiàn)圖7～圖9。

圖7 在35 ℃條件下固定化酯化酶應(yīng)用于食醋的 作用時(shí)間對(duì)食醋的催陳效果Fig.7 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 35 ℃

圖8 在40 ℃條件下固定化酯化酶應(yīng)用于 食醋的作用時(shí)間對(duì)食醋的催陳效果Fig.8 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 40 ℃

圖9 在45 ℃條件下固定化酯化酶應(yīng)用于 食醋的作用時(shí)間對(duì)食醋的催陳效果Fig.9 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 45 ℃

由圖7～圖9可知，當(dāng)固定化酯化酶添加量為9 g時(shí)，作用時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)總酯含量都達(dá)到了最大值，在35，40，45 ℃下總酯含量分別為12.6，12.87，12.76 g/L，當(dāng)時(shí)間>24 h 時(shí)總酯含量緩慢較低，可能是酯化發(fā)生了逆反應(yīng)。綜合比較分析得出：在溫度為40 ℃下，固定化酯化酶添加量為9 g時(shí)，處理24 h對(duì)食醋的催陳作用效果最佳。

固定化酯化酶作用醋的前后理化指標(biāo)的比較見(jiàn)表5，處理后食醋中氨基酸態(tài)氮含量增加，總酯含量達(dá)到12.87 g/L，相對(duì)于原醋的9.73 g/L提高了32.31%。

表5 固定化酯化酶作用醋的前后理化指標(biāo)的比較Table 5 Comparison of physicochemical indexes of immobilized esterase applied to vinegar before and after treatment g/dL

3 結(jié)論

采用食品級(jí)卡拉膠與食品級(jí)海藻酸鈉復(fù)合凝膠制作的固定化酯化酶對(duì)新醋進(jìn)行催陳，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到固定化酯化酶的最優(yōu)工藝條件：固定化載體的濃度為1.68 g/dL，載體比例為5∶2，固定化時(shí)間為153 min，固化液濃度為2.4 g/dL、酶液添加量7.23 mL。在最優(yōu)工藝條件下，固定化酯化酶相對(duì)酶活力可達(dá)到99.79%；固定化酯化酶催陳食醋的條件為：酶添加量為9 g/dL，處理時(shí)間為24 h，處理溫度為40 ℃，總酯含量可達(dá)到12.87 g/L，比新醋提高了32.31%，且口感較好，醋香柔和，酯味醇厚，對(duì)改善傳統(tǒng)食醋的陳釀方法有一定的借鑒意義，對(duì)食醋企業(yè)的發(fā)展有提升經(jīng)濟(jì)效益的作用，應(yīng)用前景廣闊。