趙延勝，吳超，王慧，周洪斌，董英，*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

采用真空冷凍干燥技術(shù)可以提高乳酸菌的保藏期，是制備高效直投式乳酸菌發(fā)酵劑最常用的技術(shù)手段[1]。但經(jīng)過凍干處理后，菌體在貯藏期間其極易遭受冷凍、氧化、融化等過程的損傷，從而影響其貯藏特性[2]。凍干保護劑的添加可以一定程度上降低菌體在凍干過程中的損傷，提高凍干菌粉的貯藏和發(fā)酵性能[3]。目前，活菌數(shù)和細胞活力是評價菌體貯藏穩(wěn)定性的重要指標，而凍干保護劑的研究和開發(fā)一般多關注于凍干和貯藏過程中菌體細胞的存活率，對于保護劑影響貯藏期間乳酸菌細胞發(fā)酵活力的作用研究相對較少。

本文在前期研究工作基礎上[4]，以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CGMCC 6016 ，L.P.dy-1） 為研對象，分析不同凍干保護劑對凍干菌體貯藏期間活菌數(shù)的影響，并結(jié)合流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析保護劑對菌體凍干后發(fā)酵活力的影響；在此基礎上，研究貯藏過程中凍干菌粉發(fā)酵活力的變化，比較不同保護劑對凍干菌粉的保護效果，為進一步開發(fā)乳酸菌功能性保護劑，以及提高直投式乳酸菌發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性，提供理論與試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.P.dy-1：由江蘇大學食品生物制造實驗室自行分離；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、甘油、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、鹽酸、乙醇、氫氧化鈉、甲醇、百里酚酞、果糖等均為二級試劑：醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑有限公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海生工生物工程公司；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂 [5-（and 6）-car boxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE]：e-Bioscience 公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9240A 型鼓風干燥機：上海一恒科技有限公司；HJ-3 控溫磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；YX400Z 高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID 型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；JLQ-S1 型菌落計數(shù)器：江蘇錫山市金誠儀器廠；7200型分光光度計：上海天達儀器有限公司；FD-8 真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；5430R 高速冷凍離心機：德國Eppendorf 公司；FACSCalibur 型流式細胞儀：美國Becton Dickinson 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 凍干菌粉的制備

直投式發(fā)酵劑的制備流程如下：

菌種活化→擴培→菌體濃縮分離→與保護劑混合→分裝、預凍→凍干

選用質(zhì)量濃度分別為10 %的菊粉、22.4 %的菊粉、菊粉復合保護劑和脫脂乳復合保護劑制備凍干菌粉[4]，將制備好的凍干菌粉經(jīng)真空包裝后，分別于-20 ℃和4 ℃條件下貯藏。

1.3.2 凍干菌粉發(fā)酵樣品的制備

前期試驗研究表明，添加不同保護劑制備的凍干菌粉發(fā)酵MRS 培養(yǎng)基（營養(yǎng)富集培養(yǎng)基）時，細胞活力無顯著性差異，而發(fā)酵營養(yǎng)匱乏培養(yǎng)基時菌體產(chǎn)酸能力不同[4]。因此本試驗選用10%質(zhì)量濃度的菊芋浸汁用于測定凍干菌體的細胞活力，其制備過程參考程新等方法[5]，但不添加任何碳氮源及礦物元素。在34 ℃條件下，按以下方式發(fā)酵10%菊芋浸汁[6]：

1）直接活化發(fā)酵：取-20 ℃保存菌種，按5%接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基中，34 ℃、12 h 活化培養(yǎng)兩次后（活菌數(shù)為 2×109CFU/mL～3×109CFU/mL），以 5%接種量加入10%菊芋浸汁。

2）直投式發(fā)酵：采用1.3.1 中添加不同保護劑制備的乳酸菌凍干菌粉（活菌數(shù)為2×1010CFU/g～6×1010CFU/g）以0.5 g/L 的接種量加入10%菊芋浸汁。

1.3.3 無細胞發(fā)酵液的制備

每隔3 h 取1.3.2 中的發(fā)酵液于無菌離心管中，在4 ℃，3 996×g 離心 10 min 后，取上清液保存于 4 ℃，用于還原糖、總糖的測定。

1.3.4 發(fā)酵液分析方法

發(fā)酵液還原糖和總糖的測定采用DNS 比色法。還原糖測定：吸取無細胞發(fā)酵液2 mL，準確加入2 mL DNS，沸水浴3 min 后立即冷卻，加入6 mL 蒸餾水，混合均勻后于540 nm 波長處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品中還原糖含量?？偺菧y定：吸取無細胞發(fā)酵液5 mL，用6 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0，沸水浴中水解1 h，然后用6 mol/L NaOH 調(diào)至pH 值為8 左右，定容至10 mL。準確吸取樣品2 mL，之后操作與還原糖測定法相同。

pH 值和活菌數(shù)的測定分別采用pH 計和梯度稀釋平板計數(shù)法。

1.3.5 乳酸菌增殖的測定方法

將制備的凍干菌粉直投發(fā)酵10%菊芋浸汁，初始接菌量控制在 1×107CFU/mL～3×107CFU/mL，立即取1 mL 菌液，4 ℃、3 996×g 離心 5 min，再用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌 2 次后，重懸至 1 mL，加入 100 μL 濃度為 50 μmol/L 的CFSE，37 ℃避光孵育10 min 后，離心、洗滌2 次。最終懸浮于1 mL 滅菌的10%菊芋浸汁中，34 ℃培養(yǎng)，并分別在6、12 h 取樣，離心、洗滌，重懸于等體積的 PBS 中，過200 目濾網(wǎng)，采用流式細胞儀對樣品進行檢測。檢測光源為氬離子激光，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為488 nm和630 nm，檢測器波長為530 nm，不設門，圈定待檢測的目標細胞，并通過CellQuest 軟件分析細胞數(shù)據(jù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 保護劑對凍干菌粉貯藏期活菌數(shù)的影響

在凍干菌粉貯藏過程中，溫度是影響菌體存活率的關鍵因素之一[7]。高溫及干燥條件會導致生物體內(nèi)發(fā)生非酶褐變,引起菌體失活。研究報道表明，高溫會加速凍干制品的融化、含水量變化和相變的發(fā)生等問題，因此溫度升高，凍干樣品的貯藏穩(wěn)定性變差。保護劑對L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的影響見圖1。

從圖1 可以看出，采用不同保護劑制備的凍干菌粉在-20 ℃貯藏8 個月，活菌數(shù)均保持在1010CFU/g 以上，且不同處理組無顯著差異；而在4 ℃下貯藏1 個月后，不同保護劑組的活菌數(shù)則發(fā)生變化，尤其4 ℃下貯藏6 個月時的活菌數(shù)下降最為顯著。表明低溫更有利于菌體活菌數(shù)的保持，該結(jié)果與已有研究報道一致[8]。

圖1 保護劑對L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect on the viable count of freeze-dried L.P.dy-1 during storage by cryoprotectant

此外，保護劑的種類也會影響凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的變化。如圖1所示，4 ℃貯藏1 個月，活菌數(shù)均保持在1.7×1010CFU/g 以上；菊粉復合保護劑組、22.4%菊粉組和脫脂乳復合保護劑組分別在4 ℃貯藏6 個月、4 個月和4 個月，活菌數(shù)仍能夠維持在1010CFU/g 以上，但8 個月后菌粉活菌數(shù)降低約1 個數(shù)量級。菌粉的貯藏穩(wěn)定性強弱順序為：菊粉復合保護劑組＞22.4%菊粉組＞脫脂乳復合保護劑組＞10 %菊粉組。試驗結(jié)果表明，采用菊粉復合保護劑制備的凍干菌粉貯藏穩(wěn)定性最佳，且分別在-20 ℃和4 ℃保藏8 個月后，活菌數(shù)可分別達到（2.07±0.05）×1010CFU/g 和（0.94±0.17）×1010CFU/g，較其他保護劑組高。

2.2 保護劑對凍干菌粉發(fā)酵活力的影響

以直接活化發(fā)酵組作為對照，采用不同保護劑制備凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中L.P.dy-1 活菌數(shù)、pH 值、還原糖及總糖的動態(tài)變化如圖2所示。

圖2 保護劑對L.P.dy-1 凍干菌粉發(fā)酵活力的影響Fig.2 Effect on the fermentation activity of freeze-dried L.P.dy-1 by cryoprotectant

保護劑是影響凍干后植物乳桿菌產(chǎn)酸能力的重要因素。由圖2 可知，相比直接活化組，添加保護劑的乳酸菌凍干后發(fā)酵10%菊芋浸汁的活力均有所下降，表現(xiàn)在發(fā)酵過程中活菌數(shù)的增長和產(chǎn)酸（pH 值）速度有所降低，其中脫脂乳復合保護劑組中的活菌數(shù)一直處于最低水平，且pH 值相對較高；菊粉保護劑組相互之間無顯著性差異，且在活菌數(shù)和產(chǎn)酸變化上較接近于活化組。

在整個發(fā)酵過程中，還原糖和總糖的含量越來越少，這與L.P.dy-1 的迅速生長和產(chǎn)酸相符合；發(fā)酵12 h 后，還原糖含量變化緩慢，可能是由于總糖的分解，L.P.dy-1 消耗的速度和分解產(chǎn)生的速度相均衡。在發(fā)酵后期，發(fā)酵液中還原糖和總糖含量幾乎不變，這可能由于酸的積累造成L.P.dy-1 代謝速度降低。從試驗結(jié)果可以看出，直接活化組的還原糖和總糖降低速度稍高于凍干組，菊粉復合保護劑組的糖代謝速率高于脫脂乳復合保護劑組，這與圖2A、圖2B 的結(jié)果相一致。

2.3 貯藏時間及溫度對凍干菌粉發(fā)酵活力的影響

在貯藏期間，L.P.dy-1 凍干菌粉的發(fā)酵活力變化如圖3所示。

圖3 L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間pH 值的變化Fig.3 Variation in the pH value of fermentation freeze-dried L.P.dy-1 with different storage time

凍干菌粉在-20 ℃保藏6 個月和4 ℃保藏4 個月后，均能夠維持較高的產(chǎn)酸活力；隨著貯藏時間的延長，菌粉的產(chǎn)酸能力明顯下降，這可能與貯藏過程中活菌數(shù)的變化有關[9]；本試驗結(jié)果同時表明，低溫貯藏更有利于菌體活力的維持，該結(jié)果與已有研究報道相一致[10]。

2.4 流式細胞術(shù)對凍干菌粉發(fā)酵活力的評價

CFSE 是一種能透過細胞膜且在胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化的非極性分子，當細胞分裂時，CFSE 標記物能夠平均分配到兩個子代細胞中，使細胞的CFSE 熒光強度減半。FCM 已被作為一種技術(shù)廣泛應用于細胞領域[11]，而且可以快速的測定凍干后菌體的存活率[12]，并描述凍干菌體的生理狀態(tài)[13]。因此，可利用CFSE 熒光強度的2 倍遞減特性，結(jié)合流式細胞術(shù)（CFSE-FCM）檢測L.P.dy-1 的增殖。試驗分別采用直接活化L.P.dy-1、菊粉保護劑凍干菌粉、脫脂乳復合保護劑凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁，分析測定發(fā)酵液中pH 值和菌體熒光強度如圖4。

圖4 pH 值與CFSE-FCM 測定菌體熒光強度的線性關系Fig.4 Linear relationship between pH value and the fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured

如圖4所示，3 組L.P.dy-1 被顯著區(qū)分，左邊pH值最低的為直接活化組，中間3 組稍高pH 值的為菊粉保護劑組，右邊pH 值最高的為脫脂乳復合保護劑組。pH 值與CFSE-FCM 的熒光強度之間表現(xiàn)出良好的相關性，R2值達到0.77，說明這兩種測定指標均可用于植物乳桿菌細胞活力的分析。

將不同處理組的L.P.dy-1 凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁，采用CFSE-FCM 分析其細胞增殖情況，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 CFSE 標記 L.P.dy-1 培養(yǎng) 0、6、12 h 后熒光強度的變化Fig.5 The fluorescence intensity of CFSE-labeled cells in cultured 0，6，12 h

由試驗結(jié)果可以看出，不同發(fā)酵時間的菌體細胞熒光強度有明顯的差異，圖A1～C1和圖A2～C2表示隨著發(fā)酵時間的延長，CFSE 標記L.P.dy-1 細胞的直方圖和散點圖明顯向左遷移，說明熒光強度明顯減弱。圖5 中E 和F 代表不同保護劑制備的凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁6 h 和12 h 時的直方圖，各組之間的差異如表1所示。

表1 L.P.dy-1 隨發(fā)酵時間熒光強度的變化情況Table 1 The fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured in different periods

凍干處理后菌體較凍干前（直接活化組）在6、12 h的熒光強度總體偏大。當以菊粉作為保護劑時，隨著菊粉濃度的增加，制備的凍干菌體的熒光強度減弱，說明高濃度的菊粉有利于菌體的增殖。其中，與脫脂乳復合保護劑組相比，菊粉保護劑組和直接活化組之間熒光強度的差異較小。

3 結(jié)論

低溫貯藏有利于維持植物乳桿菌凍干菌粉更高的發(fā)酵活力：與4 ℃貯藏條件相比，-20 ℃貯藏能夠使植物乳桿菌的活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力維持在較高水平；在以10%菊芋浸汁為發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，以菊粉作為保護劑制備的植物乳桿菌凍干菌粉能夠維持較高的發(fā)酵活力，表現(xiàn)在植物乳桿菌生長迅速、產(chǎn)酸能力強、還原糖和總糖的消耗速度快，且總體效果優(yōu)于脫脂乳復合保護劑制備的植物乳桿菌凍干菌粉。

流式細胞儀能夠快速評價不同保護劑處理凍干植物乳桿菌后細胞的增殖，其中菊粉保護劑組和直接活化組的細胞增殖更為接近，優(yōu)于脫脂乳復合保護劑組。pH 值及CFSE-FCM 測定法的關聯(lián)度良好，表明CFSE-FCM 適合凍干植物乳桿菌細胞活力的研究。