王海波，覃文霞，余婉松，袁光蔚，鄭娟梅

（1.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530021；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201206）

三聚氰胺的單分子含氮量較高，它不能在體內(nèi)代謝，過多的攝入會嚴重危害人體健康。我國衛(wèi)生部等相關(guān)部門規(guī)定[1]：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg。因此快速有效地檢測奶制品中的三聚氰胺是食品安全領(lǐng)域的迫切需求。目前，用于三聚氰胺的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]等。但上述種方法的樣品前處理步驟繁瑣、耗時長、技術(shù)成本高，不利于快速檢測。

拉曼光譜（Raman spectroscopy）是一種能夠表征分子振動能級的光譜，具有極高的分子特異性，但其散射強度較弱且易受到熒光干擾[7]。1974年Fleischmann等[8]在粗糙銀電極表面獲得吡啶的增強拉曼散射信號，這種表面增強效應(yīng)與金屬粗糙表面相關(guān)，該效應(yīng)被稱為表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）效應(yīng)。SERS 技術(shù)快速、靈敏、無損，具備分子指紋專一性和單分子靈敏性的特點，能在分子水平上提供物質(zhì)結(jié)構(gòu)的豐富信息，已逐漸成為化學(xué)、生物、環(huán)境、食品等領(lǐng)域一種強有力的檢測手段[9-12]。在食品檢測領(lǐng)域，SERS 方法檢測三聚氰胺引起了人們廣泛的研究興趣。湯俊琪等[12]采用堿性銀膠表面增強拉曼光譜技術(shù)分析了牛奶中的三聚氰胺，該試驗未對牛奶進行預(yù)處理，蛋白質(zhì)含量高的奶制品基質(zhì)會影響分析物與基底之間的吸附，拉曼增強效果不明顯；且銀膠易被氧化，穩(wěn)定性及均一性不強。

因此本試驗使用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，以去除基質(zhì)干擾，將均一性及穩(wěn)定性較強的Au@Ag NPs作為增強基底，對三聚氰胺進行SERS 檢測。本方法能有效降低基質(zhì)對待測分析物的干擾，使得待測分析物與增強基底更好的結(jié)合，進而提高三聚氰胺的檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

便攜式拉曼光譜儀（FoodDefender RM）：Thermo Fisher Scientific 公司；超純水儀（型號 A10）：Milli-Q 公司；高速離心機（型號 A-14C）：Sartorius 公司；磁力攪拌儀（型號C-MAG HS7）：IKA 公司；超聲儀（型號S300H）：Elmasonic 公司；紫外-可見分光光度計（型號UV2700）：島津公司。

1.2 試劑配制

5.0 mol/L NaCl 的制備：準確稱取 29.22 g 的 NaCl，用超純水定容至100 mL。必要時可稀釋到1.0 mol/L。

5.0 mol/L NaOH 的制備：準確稱取20.00 g 的NaOH，用超純水溶解后轉(zhuǎn)移定容至100 mL。必要時可稀釋到1.0 mol/L。

金溶膠 Au NPs（Nanoparticles 納米顆粒）的制備[13]：精確稱取0.050 g 氯金酸于500 mL 容量瓶，用超純水溶解并定容，得到0.1 g/L 的氯金酸溶液。精確稱取1.000 g 檸檬酸三鈉于100 mL 容量瓶，用超純水定容，得到10 g/L 的檸檬酸三鈉溶液。準確量取100 mL 氯金酸溶液于三口燒瓶，在磁力攪拌速率為1 100 r/min 的條件下油浴加熱至沸騰（約150 ℃），迅速速加入1 mL 上述檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱至顏色呈酒紅色后持續(xù)加熱15 min，即得到酒紅色的金溶膠溶液，冷卻后倒入棕色瓶中，4 ℃避光保存。

銀溶膠 Ag NPs 的制備[14]：稱取 45.00 mg AgNO3于圓底燒瓶中，加入250 mL 超純水溶解，安裝好冷凝回流裝置，加熱至沸，立刻加入5 mL 質(zhì)量濃度為10 g/L檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱1 h 后停止，顏色依次呈現(xiàn)淡黃、深黃、黃綠、灰色。冷卻至室溫（25 ℃）后于冰箱內(nèi)4 ℃避光保存。

銀包金溶膠 Au@Ag NPs 的制備[15]：取 50 mL 的 2×10-4moL/L 氯金酸水溶液于圓底燒瓶，油浴加熱至沸，磁力攪拌下迅速加入0.74 mL 的10 g/L 檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱5 min，至液體呈紅色不變色，冷卻至室溫（25 ℃）。取3 mL 上述紅色液體于10 mL 容量瓶中，加入400 μL 0.1 mol/L 抗壞血酸，并用磁力攪拌器攪拌，邊攪拌邊逐滴加入1 mmol/L AgNO3溶液（每次添加10 μL，每隔 30 s 加一次），共加入 AgNO3溶液 0.9 mL，所得Au@Ag NPs 于冰箱內(nèi)4 ℃避光保存。

1.3 樣品檢測方法

樣品處理方法：取0.500 g 奶粉于試管中，加入3 mL乙腈，超聲2 min，靜置20 s，用吸管吸取上清液至離心管，以10 000 r/min 離心5 min。取2 mL 上清液于試管中，加入凝聚劑（1 mL 的 5 mol/L NaCl 和 1 mL 的 1 mol/L NaOH），振蕩20 s 靜置分層，取1 mL 下層溶液至1.5 mL 離心管，以 10 000 r/min 離心 5 min，取上清液50 μL 于拉曼樣品池，加入 200 μL 水，混勻后加 50 μL增強基底Au@Ag NPs，混勻4 min 后置于便攜式拉曼光譜儀中測定。

強化描寫——把主要人物的表現(xiàn)具體清楚地寫出來，達到如見其人、如聞其聲的效果。添加語言、動作、神態(tài)、心理、情境的描寫。

測定條件：激光光源波長785 nm，激光光源功率為250 mW，光譜采集范圍250 cm-1～2 875 cm-1。為了保證自制銀包金溶膠Au@Ag NPs 增強信號的重現(xiàn)性，得到的數(shù)據(jù)具有說服力，每個樣品需重復(fù)3 次試驗，每次試驗需采集5 條光譜計算其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺標準溶液的拉曼光譜圖及峰歸屬

三聚氰胺的常規(guī)拉曼光譜圖如圖1所示。

圖1 三聚氰胺的SERS 信號圖Fig.1 SERS signal diagram of melamine

在704、1 072 cm-1附近的特征峰在圖譜中清晰可見。其中704 cm-1為環(huán)呼吸振動峰，1 072 cm-1為C-NC 鍵彎曲振動峰[16]。上述譜峰均可作為定性鑒別三聚氰胺分子的特征譜峰。

2.2 凝聚劑的考察

8 份3 mg/kg 的加標奶粉使用不同的凝聚劑按1.3試驗方法進行測定，得到結(jié)果見圖2。

圖2 不同凝聚劑對SERS 信號的影響Fig.2 Effect of different coagulants on SERS signal

僅使用NaOH 作為凝聚劑時，特征峰信號強，但基線噪音波動大；僅使用NaCl 作為凝聚劑時，無拉曼信號出現(xiàn)。這說明NaOH 可使拉曼信號增強，而NaCl 可平滑基線噪音，故使用NaCl 與NaOH 的混合溶液作為凝聚劑。使用1 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，各特征峰信號均很弱；使用1 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，1 072 cm-1處的特征峰信號較弱。使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 或者5 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，各特征峰信號清晰可見，且基線平穩(wěn)，這是因為該溶液能有效的控制金屬納米顆粒的表面化學(xué)，如pH 值、離子強度、結(jié)構(gòu)等，使得分析物與金屬納米顆粒良好接觸，等離子體共振被激發(fā)，從而得到較好的拉曼增強效果[17]。選擇使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作為凝聚劑。

2.3 三聚氰胺與增強基底的反應(yīng)時間考察

將3 mg/kg 的加標奶粉按1.3 試驗方法分別在0、1、2、3、4、5、6 min 進行測定，得到結(jié)果見圖 3。

圖3 反應(yīng)時間對SERS 信號的影響Fig.3 Influence of reaction time on SERS signal

加入增強基底Au@Ag NPs 后，三聚氰胺需要一定的時間與其反應(yīng)，4 min 即完成反應(yīng)，4 min 后所測得的拉曼光譜信號無明顯差異，可見Au@Ag NPs 與三聚氰胺反應(yīng)迅速，且兩者結(jié)合穩(wěn)定。4 min 后即可測定。

2.4 比較Au@Ag、Au和Ag NPs基底活性

2.4.1 3 種納米粒子的紫外可見吸收光譜（ultravioletvisible absorption spectrum）表征

將 1.2所制備的 3 種納米粒子 Au@Ag NPs、Ag NPs、Au NPs 分別置于紫外-可見分光光度計測定，得到結(jié)果見圖4。

圖4 Au@Ag、Au 和 Ag NPs 的 UV-vis 光譜Fig.4 UV-vis spectra and sol color of Au@Ag，Au and Ag NPs

1 mmol/L AgNO3加入量為 0.9 mL 的 Au@Ag NPs顯明亮的黃色，不同于灰色的Ag NPs 和紅色的Au NPs。此時的Au@Ag NPs 的最大吸收峰位與Ag NPs 接近。比較Au@Ag NPs 和Ag NPs 的UV-Vis 光譜可觀察到，Ag 譜線吸收峰略不對稱且相應(yīng)的半峰寬比Au@Ag NPs 寬，說明Au@Ag NPs 比純Ag NPs 的顆粒更均勻，分散性更好。Ag 殼共振變強Au 核共振弱，結(jié)果Au@Ag NPs 共振范圍從320 nm 到550 nm，共振峰寬且強，這使得它比純金屬Au 和Ag NPs 有略強的增強效果。

2.4.2 3 種納米粒子的三聚氰胺SERS 比較

3 份3 mg/kg 的加標奶粉分別使用金溶膠Au NPs、銀溶膠Ag NPs、銀包金溶膠Au@Ag NPs 作為增強基底，按1.3 試驗方法進行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 3 種納米粒子的三聚氰胺SERS 信號Fig.5 Melamine SERS signal of three kinds of nanoparticles

使用金溶膠Au NPs 做為增強基底時，熒光很強，無拉曼信號；而使用銀溶膠Ag NPs 或銀包金溶膠Au@Ag NPs 作為增強基底時，各個特征峰響應(yīng)信號較強，能得到很好的拉曼圖譜。說明金納米顆粒對三聚氰胺無SERS 增強效應(yīng)，銀納米顆粒能有效的增強三聚氰胺的SERS 信號。而Au@Ag NPs 溶膠表面為銀納米顆粒，即能增強三聚氰胺的SERS 信號，又具有金溶膠良好的均勻性、分散性和穩(wěn)定性[15]，故選擇Au@Ag NPs溶膠作為增強基底。

2.5 三聚氰胺標準溶液與基質(zhì)加標的擬合曲線對比

分別取 0.5 mL 的 0.3、0.5、1、2、3、5 μg/mL 三聚氰胺標準溶液于試管中，按1.3 的檢測方法進行測定，所得拉曼光譜圖見圖6。

圖6 三聚氰胺標準溶液的SERS 信號Fig.6 SERS signal of melamine standard solution

圖中均有明顯的特征峰，且基線平穩(wěn)。選擇704cm-1處特征峰進行定量，將其換算為1 000 cm-1曝光的峰高強度，并與標準溶液的濃度做歸一化線性擬合處理，所得標曲見圖7，三聚氰胺在該濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖7 三聚氰胺標準溶液的擬合曲線Fig.7 Fitting curve of melamine standard solution

稱取0.5 g 奶粉6 份，分別加入一定量的三聚氰胺標準溶液，得到濃度為 0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/kg的加標樣，按1.3 的檢測方法進行測定，所得拉曼光譜圖見圖8，同理繪制擬合曲線見圖9。

圖8 基質(zhì)加標三聚氰胺的SERS 信號Fig.8 SERS signal of matrix addition melamine

圖9 基質(zhì)加標三聚氰胺的擬合曲線Fig.9 Fitting curve of matrix addition melamine

三聚氰胺在該基質(zhì)加標濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，滿足定量測定要求。

2.6 檢出限的確定

將三聚氰胺含量為0.3 mg/kg 的加標奶粉按1.3操作并測定10 次，選擇704 cm-1處特征峰讀出信噪比，用3 倍信噪比求得檢出限為0.008 5 mg/kg。該值遠低于GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[18]方法一的定量限2 mg/kg。

2.7 樣品測定及加標回收試驗

將隨機購買的2 批實際樣品分別按1.3 操作，為了減小基質(zhì)干擾，采用基質(zhì)加標曲線計算其濃度，2 批樣品均未檢出三聚氰胺。2 批實際樣品均做加標回收試驗，每個加標水平分別取6 份平行樣，加標后濃度分別為 1、3、5 mg/kg，所得 SERS 信號圖見圖10、11，結(jié)果如表1所示。回收率在71.07%～91.15%之間，相對標準偏差（n=6）在1.52%～4.22%之間，該方法有較高的準確度和重現(xiàn)性，適用于奶粉中的三聚氰胺檢測。

圖10 樣品1 各濃度加標試驗的平均拉曼光譜圖Fig.10 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample1

圖11 樣品2 各濃度加標試驗的平均拉曼光譜圖Fig.11 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample2

3 結(jié)論與討論

本研究建立表面增強拉曼光譜快速測定奶粉中三聚氰胺的方法。用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，去除基質(zhì)對拉曼檢測的影響；制備三種納米粒子并用UV-Vis 對其進行表征，得知Ag@Au NPs 有較好均勻性、分散性及拉曼增強效果；比較3 種納米粒子對三聚氰胺的拉曼增強效果再次驗證Ag@Au NPs 的SERS 增強效果較好；優(yōu)化凝聚劑、反應(yīng)時間等拉曼增強條件，以獲得最佳的SERS 信號。本方法檢出限為0.008 5 mg/kg，回收率在71.07%～91.15%，RSD 相對標準偏差（n=6）在1.52%～4.22%，準確度及精密度好，靈敏度高，操作簡單，10 min 內(nèi)能完成檢測，可實現(xiàn)快速測定奶粉中三聚氰胺，有望應(yīng)用于其他復(fù)雜基質(zhì)食品的分析測定。

表1 樣品的測定結(jié)果及加標回收實驗結(jié)果Table 1 Determination results of sample and results of recovery experiments