殷惠，陳龍，張文遠(yuǎn)，朱新杰，許諾，王婷婷，盛復(fù)庚

1.安徽醫(yī)科大學(xué) 解放軍307臨床學(xué)院，北京 100071；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)放射科，北京 100071；3.北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871

近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的納米材料用于癌癥的靶向成像及治療，但普遍存在安全性及生物相溶性差的缺點(diǎn)[1]。鐵蛋白是人體內(nèi)普遍存在的鐵代謝蛋白，生理狀態(tài)下形成24 聚體的籠狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)外徑分別為8、12 nm，其內(nèi)部空腔可以載藥[2-4]。鐵蛋白作為藥物載體具有生物相容性高及易于工程改造的優(yōu)點(diǎn)[5]。目前，很多研究以鐵蛋白作為載體，包載治療或成像藥物，進(jìn)行癌癥的診斷或治療[6]。其機(jī)理主要是借助重鏈鐵蛋白（heavy chain ferritin，HFn）與人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）結(jié)合，發(fā)揮其功能[7]。但從靶向腫瘤遞送角度，需要增加鐵蛋白的靶向性，使其更好地定位于腫瘤細(xì)胞，因而提高其靶向性也是目前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。通過(guò)不同靶向配體的化學(xué)修飾，或遺傳修飾的方法提高鐵蛋白的靶向性，已經(jīng)取得了一些成功。相關(guān)報(bào)道如在鐵蛋白表面修飾RGD，通過(guò)RGD 與整合素αⅤβ3的結(jié)合，將鐵蛋白靶向癌細(xì)胞；或?qū)㈣F蛋白與細(xì)胞黏附分子偶聯(lián)，靶向內(nèi)皮，從而提高對(duì)肺血管系統(tǒng)的靶向等[8-9]。單克隆抗體作為特異性的靶向分子，將鐵蛋白與臨床常用抗體偶聯(lián)，既可以提高鐵蛋白的靶向性，也有利于將鐵蛋白納米材料向臨床轉(zhuǎn)化。

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）是臨床上許多腫瘤如乳腺癌、胃癌等的重要治療靶點(diǎn)。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)的乳腺癌發(fā)病率逐年上升，并且患者中的15%～23%表現(xiàn)為HER2 陽(yáng)性[10]。曲妥珠單抗（商品名為赫賽?。┳鳛橐环N人源化的單克隆抗體，可以特異地與表面高表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-depen?dent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）產(chǎn)生抗腫瘤活性，是臨床治療乳腺癌的主要方式之一[11-12]。雖然曲妥珠單抗的靶向治療改善了HER2 陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后，但仍有相當(dāng)一部分患者會(huì)復(fù)發(fā)并死亡。目前，除了繼續(xù)研究靶點(diǎn)不同的分子靶向藥物，針對(duì)關(guān)鍵基因、信號(hào)通路等的研究也在探索中。但臨床研究更傾向于將不同機(jī)制靶向藥物進(jìn)行聯(lián)合治療，如將靶向藥物與化療藥物聯(lián)合使用，或?qū)邢蛩幬锱c內(nèi)分泌聯(lián)合治療等[13]。盡管有關(guān)曲妥珠單抗治療的臨床數(shù)據(jù)豐富，但許多重要問(wèn)題仍未得到解決，包括最佳治療持續(xù)時(shí)間，以及如何最好地將曲妥珠單抗與細(xì)胞毒性試劑和其他藥劑聯(lián)合使用以最大限度地提高療效，同時(shí)盡量減少毒性等。2016年有關(guān)MM-302的實(shí)驗(yàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，主要是設(shè)計(jì)一種既有HER2 陽(yáng)性細(xì)胞靶向性，又有抗腫瘤細(xì)胞毒性的靶向-化療藥物偶聯(lián)物，以曲妥珠單抗為靶向分子，以期達(dá)到減毒增效的目的[14]。

在本研究中，我們采用類似于抗體偶聯(lián)藥物（antibody drug conjugate，ADC）的設(shè)計(jì)思路，將臨床常用抗HER2 抗體（曲妥珠）與載體材料HFn 偶聯(lián)成靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2，從而增加對(duì)HER2 陽(yáng)性的乳腺癌（HER2+MDA-MB-231-Luci）的腫瘤靶向。結(jié)果表明靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 在體內(nèi)外能更好地靶向HER2 陽(yáng)性細(xì)胞，驗(yàn)證了臨床常用抗體與HFn 偶聯(lián)的可能性，結(jié)合鐵蛋白藥物載體和抗體高靶向性的優(yōu)勢(shì)，可以大大提升鐵蛋白在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8 周齡 SPF 級(jí) BLBC/c 雌性裸鼠（北京維通利華有限公司），實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（許可證編號(hào)為L(zhǎng)A2018033）；標(biāo)記螢光素酶基因的HER2 陽(yáng)性及陰性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231-Luci（本實(shí)驗(yàn)室保存）；重鏈鐵蛋白菌種由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)趙廣華教授提供；大腸桿菌BL21 感受態(tài)（天根生化有限公司）；質(zhì)粒小提試劑盒、蛋白 marker、BCA 試劑盒、TEMED（Bio-Rad 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（上海素爾生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（上海捷倍思基因技術(shù)有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（100×）（碧云天生物技術(shù)）；Mal-PEG-NHS（ToYongBio 公司）；曲妥珠單抗（國(guó)藥準(zhǔn)字J20110020）；D-熒光素鉀鹽（Thermo Fisher Scientific 公司）；其余所用試劑均為分析純。

AKTA start 蛋白純化儀、Superdex 200 凝膠過(guò)濾柱（GE Healthcare 公司）；純水儀（Milli-pore 公司）；小動(dòng)物活體成像儀IVIS LuminaⅢ（珀金埃爾默公司）；分光光度計(jì)Nanodrop2000C（Thermo Sci?entific 公司）；馬爾文粒徑分析儀（Malvern Instru?ment 公司）；透射電子顯微鏡（日立公司）；激光共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司公司）。

1.2 重鏈鐵蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

將 10 μL 菌液接種到 1 mL 含 100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振搖1 h，提取質(zhì)粒，測(cè)序。蛋白表達(dá)純化過(guò)程參照Uchi?da 等的方法[15]，但加熱步驟改為在65℃而不是60℃下進(jìn)行，并使用鎳柱純化。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素的10 mL LB 培養(yǎng)液試管中，37℃、220 r/min 振搖 4～6 h；按 1∶100 接種于含 100 μg/mL 氨芐青霉素的 1 L LB 培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min 振搖至菌液D600nm為 0.6～0.8（約 4～6 h）；加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37℃、220 r/min 振搖過(guò)夜，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；離心收菌，用PBS 重懸沉淀；重懸液經(jīng)超聲波破碎后，65℃加熱15 min，離心；將上清緩慢加入硫酸銨（濃度約50%），4℃攪拌2 h，4℃冰箱過(guò)夜，12 000 r/min 離心10 min，倒掉上清，沉淀復(fù)溶；65℃水浴加熱15 min，離心15 min 收集上清，過(guò)0.22 μm 濾膜后，用 30 kD 超濾管超濾 3 次，除硫酸銨，過(guò)鎳柱，收集蛋白；30 kD 超濾管超濾，除咪唑并濃縮至2 mL，過(guò)Superdex 200 凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行尺寸排阻層析；取層析后蛋白進(jìn)行12% SDSPAGE，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用DMEM 培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HER2 表達(dá)陽(yáng)性及陰性的乳腺癌細(xì)胞HER2+MDA-MB-231-Luci 和HER2-MDA-MB-231-Luci，培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素。

1.4 靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的制備

異雙功能交聯(lián)劑馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯（Mal-PEG-NHS）用于人重鏈鐵蛋白與抗體的結(jié)合。偶聯(lián)過(guò)程如Elisabetta 所述[16]。室溫下取10 mg anti-HER2 與5 mg Mal-PEG-NHS，在 2 mL PBS 溶液（pH7.5）中反應(yīng) 30 min，以30 kD 超濾管超濾除去未反應(yīng)的Mal-PEG-NHS；再將其與人重鏈鐵蛋白在室溫下于PBS 緩沖液（pH7.0）里偶聯(lián) 1 h，30 kD 超濾管超濾 3 次，12 000 r/min 離心 10 min，過(guò) 0.22 μm 濾膜，4℃冰箱保存；用Superdex 200 凝膠色譜柱通過(guò)尺寸排阻凝膠色譜（SEC）純化復(fù)合后的納米載體；用 PBS 溶液（pH7.4），設(shè)置流速為 1 mL/min，純化樣品以除去游離抗體并收集分離純化后的HFn/anti-HER2。

1.5 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的表征

用馬爾文粒徑分析儀進(jìn)行HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料的尺寸和Zeta 電位分析。樣品用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，用去離子水稀釋至0.5 mg/mL。粒徑大小分布是通過(guò)數(shù)據(jù)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的。

用透射電子顯微鏡分析HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料。用去離子水稀釋至0.5 mg/mL，滴一滴在碳支持膜上，3 min 后用濾紙吸干，再用磷鎢酸染色，2 min 后用濾紙吸干，并干燥，在80 kV的加速電壓下觀察。

1.6 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的熒光標(biāo)記

用Cy5.5-NHS 標(biāo)記目標(biāo)蛋白。HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料標(biāo)記相同量的熒光，蛋白與熒光以1∶2eq 比例標(biāo)記，避光室溫振蕩反應(yīng)過(guò)夜，通過(guò)G-25 Sephadex 脫鹽柱去除游離熒光團(tuán)。本研究用BCA 試劑盒測(cè)量蛋白濃度，分光光度計(jì)測(cè)定熒光標(biāo)記后的熒光強(qiáng)度。

1.7 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的體內(nèi)外靶向

將HER2 陽(yáng)性及陰性的乳腺癌細(xì)胞接種在共聚焦皿中，將熒光標(biāo)記的納米材料加入相應(yīng)的細(xì)胞中（Cy5.5 終濃度為200 nmol/L），在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min；用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入DAPI染液（終濃度50 ng/mL）孵育15 min；再用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入100 μL PBS；用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光顯像。

根據(jù)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立HER2陽(yáng)性乳腺癌荷瘤裸鼠模型，每只鼠肩背部接種5×105HER2 陽(yáng)性 MDA-MB-231-Luci 細(xì)胞，1 周后進(jìn)行生物發(fā)光成像。尾靜脈注射熒光標(biāo)記的對(duì)照組 HFn-Cy5.5、實(shí)驗(yàn)組 HFn/anti-HER2-Cy5.5 納米材料（Cy5.5 濃度為40 nmol/kg，120 μL），注射后0、2、8、24、48、96、144 h 分別用小動(dòng)物活體成像儀進(jìn)行熒光成像，并進(jìn)行熒光信號(hào)統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，2 組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人鐵蛋白重鏈的制備

鐵蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE，可見(jiàn)清晰的鐵蛋白亞基條帶（圖1），蛋白帶條帶單一，表明得到的HFn 純度高。

2.2 人重鏈鐵蛋白與抗HER2抗體的偶聯(lián)

用雙功能交聯(lián)劑Mal-PEG-NHS 將抗體和重鏈鐵蛋白偶聯(lián)（圖2），獲得的復(fù)合物通過(guò)尺寸排阻凝膠色譜表征，以確定交聯(lián)反應(yīng)是否產(chǎn)生預(yù)期的可溶性大分子物質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)圖3，HER2 抗體吸收峰位置約在65 mL 處；偶聯(lián)后鐵蛋白吸收峰（55 mL 處）消失，在45 mL 處出現(xiàn)一個(gè)新的主峰即為HFn/anti-HER2，表明鐵蛋白與抗HER2 抗體偶聯(lián)成功。用HPLC 進(jìn)行HER2 抗體的定量分析，計(jì)算HFn 綴合物的偶聯(lián)比例，HFn 與HER2 抗體起始摩爾比為1∶3.2，約59%的游離HER2 抗體在65 mL 處洗脫出來(lái)，對(duì)應(yīng)于HFn，這表明每個(gè)HFn連接的HER2 抗體約為1.3 個(gè)。

2.3 靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的表征

通過(guò)透射電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射表征HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2。透射電子顯微鏡顯示HFn（圖4A）為特征性的納米殼-核結(jié)構(gòu)，復(fù)合物HFn/anti-HER2（圖4B）仍表現(xiàn)為特征性的納米球形結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)光散射頻率曲線（圖4C）顯示復(fù)合后流體動(dòng)力學(xué)直徑增加，單獨(dú)的HFn的平均直徑為7.11±0.12 nm，而復(fù)合物HFn/anti-HER2的平均直徑為16.88±0.49 nm（表1）。多分散指數(shù)（PDI）表明，和未與HER2 抗體偶聯(lián)的HFn 相比，復(fù)合物HFn/anti-HER2的單分散水平相似（分別為0.18±0.01 vs.0.16±0.03），兩者分散性很好，在水溶液中HFn 與靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的Zeta 電勢(shì)分別為-9.82±1.51、-6.59±0.86 mV。

2.4 復(fù)合物HFn/anti-HER2的體內(nèi)外靶向驗(yàn)證

圖1 重鏈鐵蛋白親和純化的SDS-PAGE分析

圖2 HER2抗體與HFn偶聯(lián)過(guò)程模式圖

為了在體外驗(yàn)證靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的靶向性，首先進(jìn)行了體外表征。腫瘤細(xì)胞在Cy5.5 通道信號(hào)（紅色）（波長(zhǎng)設(shè)置為670 nm）結(jié)果顯示，靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 相對(duì)于HFn 本身在HER2 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度更高（圖5，3～4）。同時(shí)，HER2 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中較HER2 陰性細(xì)胞中熒光強(qiáng)度更高。表明靶向復(fù)合物 HFn/anti-HER2-Cy5.5 增加了 HFn 對(duì) HER2 陽(yáng)性乳腺癌的靶向性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證靶向復(fù)合物的靶向性，HFn與靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 標(biāo)記熒光基團(tuán)Cy5.5之后分別于尾靜脈注入HER2 陽(yáng)性乳腺癌荷瘤鼠，體內(nèi)熒光成像結(jié)果如圖6所示，可以看出靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 在24 h 左右出現(xiàn)明顯的腫瘤富集現(xiàn)象，并在48 h 左右達(dá)到峰值，之后在96 h 內(nèi)都保持了良好的靶向；對(duì)照之下，HFn 在長(zhǎng)達(dá)144 h 范圍內(nèi)未出現(xiàn)明顯的腫瘤富集現(xiàn)象。此外，熒光強(qiáng)度測(cè)量分析（圖7）表明HFn/anti-HER2在體內(nèi)表現(xiàn)出更長(zhǎng)的保留時(shí)間（24～72 h）。

圖3 HFn、游離HER2抗體及靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的尺寸排阻凝膠色譜曲線

圖4 HFn（A）和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2（B）的透射電子顯微鏡圖像（比例尺：100 nm）；C為通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射獲得的HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的頻率曲線

表1 HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的直徑、多分散指數(shù)（PDI）及Zeta電勢(shì)（x±s，n=3）

圖5 細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HFn及靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2對(duì)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤靶向性

3 討論

納米材料靶向成像及載藥是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其可通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留（enhanced permea?bility and retention，EPR）效應(yīng)及與主動(dòng)靶向方式靶向腫瘤[17-18]。鐵蛋白作為一種生物納米材料具有良好的生物相容性，無(wú)免疫原性，并且其內(nèi)部空腔可以作為藥物載體裝置，因此在腫瘤的診斷與治療方面展現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)[19-20]。作為備受關(guān)注的天然藥物載體，如何對(duì)鐵蛋白進(jìn)行修飾以提高其靶向性，一直是研究的熱點(diǎn)。目前提高其靶向性主要通過(guò)靶向修飾配體、抗體，但未將其與臨床常用靶向治療分子連用。目前單克隆抗體的靶向性和特異性受到研究者青睞[21]，因此，利用抗體結(jié)合提升鐵蛋白的靶向性是適當(dāng)可行的思路。HER2 是HER2 陽(yáng)性乳腺癌靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，作為模型抗體具有很高的研究和臨床價(jià)值。

圖6 HER2陽(yáng)性乳腺癌荷瘤鼠的腫瘤靶向性成像

圖7 HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2在HER2陽(yáng)性乳腺癌荷瘤鼠模型中的熒光強(qiáng)度分析

我們利用HER2 抗體對(duì)腫瘤的高靶向特性，將人重鏈鐵蛋白作為藥物或試劑載體與之相連，發(fā)揮HER2 抗體的良好腫瘤靶向性及鐵蛋白的載體特性，構(gòu)建一個(gè)靶向復(fù)合物納米載體平臺(tái)。本研究探討了人重鏈鐵蛋白與臨床常用HER2 抗體連用的可能性，人重鏈鐵蛋白可以與HER2 抗體以1∶1.3的比例連接，在體內(nèi)靶向腫瘤成像時(shí)，成像平均熒光強(qiáng)度在48 h 達(dá)到最強(qiáng)，靶向性是重鏈鐵蛋白本身的3 倍，說(shuō)明鐵蛋白的靶向性增加，有利于將其進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，具有研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)潛能。有文獻(xiàn)報(bào)道，修飾后的鐵蛋白可以裝載更多的化療藥物或成像分子，且擁有較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，故能更好地用于腫瘤的治療[8]。本研究運(yùn)用熒光標(biāo)記檢測(cè)，在體內(nèi)外觀察到良好的靶向性，關(guān)于載藥后成像及治療還在進(jìn)一步研究中。

綜上，我們構(gòu)建了人重鏈鐵蛋白-抗體偶聯(lián)物，人重鏈鐵蛋白作為藥物載體，臨床常用抗體作為靶向分子，極大地提升了鐵蛋白的腫瘤靶向性，增強(qiáng)了鐵蛋白在腫瘤診斷和治療方面的潛力，為后續(xù)鐵蛋白的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行思路。