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        豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與RV-23抗菌肽復(fù)合材料的制備及生物學(xué)特性初步研究

        2019-05-07 09:46:22李文季守平
        生物技術(shù)通訊 2019年2期
        關(guān)鍵詞:管中抗菌肽抗原

        李文,季守平

        軍事醫(yī)學(xué)研究院 衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所,北京 100850

        脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)是組織再生修復(fù)材料的研發(fā)熱點(diǎn)。ADM 是將人或動(dòng)物的真皮組織用物理化學(xué)和生物方法去除表皮及皮內(nèi)細(xì)胞成分后獲得的細(xì)胞外基質(zhì)成分,具有天然三維結(jié)構(gòu)[1]。ADM的主要成分,如膠原蛋白、非膠原糖蛋白、彈力纖維、分散在彈力纖維中的黏多糖、蛋白聚糖和結(jié)締組織糖蛋白都與創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)[2]。ADM 材料能夠吸附血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF),維持其生物活性[3]。此外,ADM 降解產(chǎn)生的甘氨酰-組氨酰-賴氨酸(GHK)三肽,也具有促進(jìn)膠原、黏多糖和蛋白聚糖合成,激發(fā)脯氨酸酶活性,促進(jìn)血管生成等生物學(xué)功能,加速傷口愈合[4-5]。ADM 生物相容性好,不易損壞,具有良好的細(xì)胞親和性。而且,ADM 成分結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境相似,能誘導(dǎo)上皮組織再生,應(yīng)用前景廣闊[6]。按來(lái)源不同,ADM 可分為人ADM 和異種ADM。人ADM 免疫反應(yīng)低、療效好,但來(lái)源有限,難以在臨床上大量應(yīng)用[7]。因此,來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(porcine ADM,PADM)進(jìn)入人們的研究視野。PADM 在皮膚的三維結(jié)構(gòu)、生物性狀和免疫特性等方面與人的相似,已在燒傷、整形、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-10]。但是,PADM 殘留異種抗原(α-Gal 抗原)會(huì)引起較強(qiáng)的異種免疫反應(yīng)。我們?cè)谇捌谘芯恐?,用?半乳糖苷酶清除α-Gal 抗原,獲得低免疫原PADM。經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局檢定,發(fā)現(xiàn)α-Gal 抗原清除率超過(guò)90%[11]。

        為了避免傷口愈合和組織修復(fù)中可能發(fā)生的細(xì)菌感染,我們將抗菌肽RV-23 與PADM 微?;旌?,制備兼具抗感染及再生修復(fù)功能的復(fù)合材料。RV-23 來(lái)源于加州紅腿蛙[12],由23 個(gè)氨基酸殘基組成,具有α螺旋結(jié)構(gòu),可與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)菌去極化,使細(xì)胞膜形成孔洞,導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡,具有廣譜抑制細(xì)菌生長(zhǎng)活性[13]。據(jù)報(bào)道,作為一種細(xì)菌選擇性抗菌肽,RV-23 具有良好的血液相容性,不影響紅細(xì)胞、血小板、白蛋白、凝血系統(tǒng)等血液成分的結(jié)構(gòu)和功能[14]。但RV-23 單獨(dú)使用對(duì)真核細(xì)胞也有一定的細(xì)胞毒性,阻礙了其臨床應(yīng)用。在本研究中,我們制備的PADM 和RV-23 復(fù)合材料具有較強(qiáng)的抗菌性和較低的溶血性,對(duì)真核細(xì)胞的毒性進(jìn)一步減弱,且該材料穩(wěn)定性強(qiáng),作為新型醫(yī)用抗菌敷料具有良好的使用價(jià)值和開發(fā)前景。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人表皮角化細(xì)胞HaCaT 由本實(shí)驗(yàn)保存;人新鮮全血由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心輸血科提供;PADM 薄片及粉末由本實(shí)驗(yàn)室制備;RV-23 抗菌肽由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成;DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;增強(qiáng)型CCK-8 試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;Tricine-SDS-PAGE 凝膠試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉購(gòu)自Sigma 公司;TritonX-100 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 制備PADM/RV-23復(fù)合材料

        用無(wú)菌超純水將抗菌肽溶解成1000 μmol/L的母液;將PADM 用純水清洗3 次,每次1 h,用打孔器切成直徑6 mm 厚度約1 mm的小圓片,在超凈工作臺(tái)中晾干,分別加入20、5、1 μL 抗菌肽溶液,在超凈工作臺(tái)上完全晾干,制備PADM/RV-23復(fù)合材料。

        1.3 菌落計(jì)數(shù)

        挑取大腸桿菌DH5α于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中,200 r/min、37℃振蕩過(guò)夜,待D600nm為0.5(2×108CFU/mL)時(shí),用 PBS 稀釋至 1/1000,吸取 100 μL 于 1.5 mL的 EP 管中,向 EP 管中加入 PADM/RV-23 復(fù)合材料,37℃孵育 2 h,用 PBS 稀釋至 1/100,取 100 μL 涂固體 LB 平板,37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng),拍照計(jì)數(shù)。

        1.4 溶血實(shí)驗(yàn)

        人新鮮紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3 次,每次加入10 mL 生理鹽水,混勻,2000 r/min 離心5 min。洗滌后,用PBS 稀釋為1%壓積的紅細(xì)胞,向1.5 mL的 EP 管中加入 500 μL,再加入 PADM/RV-23 復(fù)合材料,用1%的TritonX-100 作為陽(yáng)性對(duì)照,不加復(fù)合材料而只加PBS 作為陰性對(duì)照,37℃孵育 30 min,500 r/min 離心5 min,拍照,取上清液 100 μL 至 96 孔板中,檢測(cè)D450nm值。

        1.5 CCK-8真核細(xì)胞毒性檢測(cè)

        將HaCaT 或NIH-3T3 細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù),以5×103/孔的密度接種到96 孔板,37℃恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為70%~80%,向EP 管中加入200 μL 無(wú)血清的DMEM(HaCaT細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基),加入PADM/RV-23 復(fù)合材料,37℃孵育2 h,加入含20%胎牛血清的DMEM,混勻后換到96 孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入增強(qiáng)型CCK-8 溶液,37℃孵育1.5 h,測(cè)D450nm值。

        1.6 考馬斯亮藍(lán)染色

        取10 mg PADM/RV-23 復(fù)合材料凍干粉末于EP 管中,加入 100 μL 去離子水,再加入 2×還原性Tricine 專用上樣緩沖液100 μL,100℃煮沸8 min。配制16.5%的分離膠和夾層膠、濃縮膠,30 V 電壓預(yù)電泳 10 min,再加入 20 μL 樣品,30 V電壓電泳60 min,然后100 V 電壓電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)底部。電泳結(jié)束后,將Tricine-SDS-PAGE 膠放入燒杯中,加入考馬斯亮藍(lán)染色液,覆蓋膠面,放置在水平搖床上染色過(guò)夜,倒出染色液,加入脫色液脫色4~6 h,加入去離子水浸泡,拍照。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 19 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PADM/RV-23復(fù)合材料具有較高的抗菌活性

        由圖1可以看出,PADM 和 PADM/RV-23 復(fù)合材料對(duì)細(xì)菌都有不同程度的抑制作用。隨著RV-23 濃度的升高,PADM/RV-23 復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌存活越來(lái)越低,當(dāng)RV-23 濃度為20 μmol/L時(shí),細(xì)菌存活僅為(0.59±1.15)%,提示RV-23 復(fù)合PADM 后仍然具有較好的抗菌效果。

        2.2 PADM/RV-23復(fù)合材料具備較低的溶血能力

        據(jù)報(bào)道,抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞膜上打孔致使細(xì)胞破裂、死亡[15],因此我們檢測(cè)了PADM/RV-23 復(fù)合材料對(duì)紅細(xì)胞的溶血能力,發(fā)現(xiàn)PADM 可以降低RV-23的溶血活性。無(wú)論復(fù)合材料還是RV-23 組,隨著抗菌肽RV-23 濃度的升高,溶血活性都會(huì)提高,但同濃度相比,復(fù)合材料組的溶血活性低于RV-23 組(圖2)。

        以上結(jié)果提示,PADM 對(duì)RV-23的溶血性能具有很好的屏蔽作用,很大程度地減弱了抗菌肽RV-23 對(duì)真核紅細(xì)胞膜的溶破作用。

        2.3 PADM/RV-23復(fù)合材料對(duì)上皮細(xì)胞無(wú)副作用

        圖1 PADM/RV-23復(fù)合材料顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)

        由于PADM 敷料基本應(yīng)用于傷口創(chuàng)面,我們檢測(cè)了PADM/RV-23 復(fù)合材料對(duì)人表皮角化細(xì)胞HaCaT 和鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RV-23 對(duì)2 種細(xì)胞的毒性隨著濃度的升高而增加,PADM/RV-23 復(fù)合材料基本不影響HaCaT 和NIH-3T3的增殖(圖3)。例如,對(duì)于HaCaT 細(xì)胞,RV-23 濃度為 20 μmol/L 時(shí) PR20 組細(xì)胞活性為(103.97 ± 2.33)% ,單獨(dú)RV-23組為(37.46 ±4.27)%。對(duì)于NIH-3T3 細(xì)胞,也取得類似結(jié)果。

        2.4 PADM/RV-23復(fù)合材料性質(zhì)穩(wěn)定

        將制備的復(fù)合材料室溫保存1 個(gè)月,然后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE,檢測(cè)RV-23 是否降解。結(jié)果見(jiàn)圖4,當(dāng)PADM/RV-23 復(fù)合材料所含RV-23抗菌肽濃度分別為1、5 和20 μmol/L 時(shí)都有明顯條帶,說(shuō)明該復(fù)合材料室溫放置1 個(gè)月后RV-23仍然沒(méi)有降解,提示該復(fù)合材料較穩(wěn)定。

        圖2 PADM/RV-23復(fù)合材料對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用

        圖3 PADM/RV-23復(fù)合材料對(duì)上皮細(xì)胞的毒性

        圖4 抗菌肽RV-23的Tricine-SDS-PAGE

        3 討論

        豬皮結(jié)構(gòu)與人皮膚結(jié)構(gòu)相似,具有保持傷口濕潤(rùn)環(huán)境、減少疼痛、促進(jìn)痊愈、減少瘢痕形成等作用,可用于深度燒傷的治療,但其臨床應(yīng)用的最大障礙是異種免疫排斥反應(yīng)。脫細(xì)胞制備PADM 過(guò)程中,去除了大部分異種抗原,大大降低了免疫排斥反應(yīng)。同時(shí),PADM 保留了完整的膠原三維結(jié)構(gòu),不僅為再生修復(fù)提供支架,還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增殖、分化,加快傷口愈合[16-17],因此廣泛用于創(chuàng)傷、燒傷治療以及整形美容等領(lǐng)域[18]。目前市場(chǎng)上的PADM 有α-Gal 抗原,免疫原性高。為此,我們實(shí)驗(yàn)室用α-半乳糖苷酶清除PADM 上的α-Gal 抗原,制備了免疫原性更低、生物相容性更好的PADM。

        感染是影響創(chuàng)面愈合的重要因素,而耐藥菌感染不僅延誤創(chuàng)傷治療,而且有可能危及患者生命。在本研究中,我們將抗菌肽RV-23 和低免疫原PADM 結(jié)合,制備了PADM/RV-23 復(fù)合材料,評(píng)價(jià)其抗菌性、溶血性以及對(duì)HaCaT 和NIH-3T3 細(xì)胞的毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該復(fù)合物在保留了較強(qiáng)抑菌作用的同時(shí),還具備紅細(xì)胞的溶血作用較低,對(duì)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn),性質(zhì)穩(wěn)定,作為新型抗菌敷料具有良好的使用價(jià)值和開發(fā)前景。

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