李文，季守平

軍事醫(yī)學研究院 衛(wèi)生勤務與血液研究所，北京 100850

脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）是組織再生修復材料的研發(fā)熱點。ADM 是將人或動物的真皮組織用物理化學和生物方法去除表皮及皮內細胞成分后獲得的細胞外基質成分，具有天然三維結構[1]。ADM的主要成分，如膠原蛋白、非膠原糖蛋白、彈力纖維、分散在彈力纖維中的黏多糖、蛋白聚糖和結締組織糖蛋白都與創(chuàng)傷修復密切相關[2]。ADM 材料能夠吸附血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），維持其生物活性[3]。此外，ADM 降解產(chǎn)生的甘氨酰-組氨酰-賴氨酸（GHK）三肽，也具有促進膠原、黏多糖和蛋白聚糖合成，激發(fā)脯氨酸酶活性，促進血管生成等生物學功能，加速傷口愈合[4-5]。ADM 生物相容性好，不易損壞，具有良好的細胞親和性。而且，ADM 成分結構與細胞生長的微環(huán)境相似，能誘導上皮組織再生，應用前景廣闊[6]。按來源不同，ADM 可分為人ADM 和異種ADM。人ADM 免疫反應低、療效好，但來源有限，難以在臨床上大量應用[7]。因此，來源廣泛、價格低廉的豬脫細胞真皮基質（porcine ADM，PADM）進入人們的研究視野。PADM 在皮膚的三維結構、生物性狀和免疫特性等方面與人的相似，已在燒傷、整形、創(chuàng)傷修復等領域得到廣泛應用[8-10]。但是，PADM 殘留異種抗原（α-Gal 抗原）會引起較強的異種免疫反應。我們在前期研究中，用α-半乳糖苷酶清除α-Gal 抗原，獲得低免疫原PADM。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局檢定，發(fā)現(xiàn)α-Gal 抗原清除率超過90%[11]。

為了避免傷口愈合和組織修復中可能發(fā)生的細菌感染，我們將抗菌肽RV-23 與PADM 微粒混合，制備兼具抗感染及再生修復功能的復合材料。RV-23 來源于加州紅腿蛙[12]，由23 個氨基酸殘基組成，具有α螺旋結構，可與細菌細胞膜結合，誘導細菌去極化，使細胞膜形成孔洞，導致細菌裂解死亡，具有廣譜抑制細菌生長活性[13]。據(jù)報道，作為一種細菌選擇性抗菌肽，RV-23 具有良好的血液相容性，不影響紅細胞、血小板、白蛋白、凝血系統(tǒng)等血液成分的結構和功能[14]。但RV-23 單獨使用對真核細胞也有一定的細胞毒性，阻礙了其臨床應用。在本研究中，我們制備的PADM 和RV-23 復合材料具有較強的抗菌性和較低的溶血性，對真核細胞的毒性進一步減弱，且該材料穩(wěn)定性強，作為新型醫(yī)用抗菌敷料具有良好的使用價值和開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

人表皮角化細胞HaCaT 由本實驗保存；人新鮮全血由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心輸血科提供；PADM 薄片及粉末由本實驗室制備；RV-23 抗菌肽由北京賽百盛基因技術有限公司合成；DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；增強型CCK-8 試劑購自碧云天生物技術有限公司；Tricine-SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉購自Sigma 公司；TritonX-100 購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 制備PADM/RV-23復合材料

用無菌超純水將抗菌肽溶解成1000 μmol/L的母液；將PADM 用純水清洗3 次，每次1 h，用打孔器切成直徑6 mm 厚度約1 mm的小圓片，在超凈工作臺中晾干，分別加入20、5、1 μL 抗菌肽溶液，在超凈工作臺上完全晾干，制備PADM/RV-23復合材料。

1.3 菌落計數(shù)

挑取大腸桿菌DH5α于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃振蕩過夜，待D600nm為0.5（2×108CFU/mL）時，用 PBS 稀釋至 1/1000，吸取 100 μL 于 1.5 mL的 EP 管中，向 EP 管中加入 PADM/RV-23 復合材料，37℃孵育 2 h，用 PBS 稀釋至 1/100，取 100 μL 涂固體 LB 平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)，拍照計數(shù)。

1.4 溶血實驗

人新鮮紅細胞用生理鹽水洗滌3 次，每次加入10 mL 生理鹽水，混勻，2000 r/min 離心5 min。洗滌后，用PBS 稀釋為1%壓積的紅細胞，向1.5 mL的 EP 管中加入 500 μL，再加入 PADM/RV-23 復合材料，用1%的TritonX-100 作為陽性對照，不加復合材料而只加PBS 作為陰性對照，37℃孵育 30 min，500 r/min 離心5 min，拍照，取上清液 100 μL 至 96 孔板中，檢測D450nm值。

1.5 CCK-8真核細胞毒性檢測

將HaCaT 或NIH-3T3 細胞消化、離心、計數(shù)，以5×103/孔的密度接種到96 孔板，37℃恒溫培養(yǎng)至細胞匯合率為70%～80%，向EP 管中加入200 μL 無血清的DMEM（HaCaT細胞用MEM培養(yǎng)基）,加入PADM/RV-23 復合材料，37℃孵育2 h，加入含20%胎牛血清的DMEM，混勻后換到96 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入增強型CCK-8 溶液，37℃孵育1.5 h，測D450nm值。

1.6 考馬斯亮藍染色

取10 mg PADM/RV-23 復合材料凍干粉末于EP 管中，加入 100 μL 去離子水，再加入 2×還原性Tricine 專用上樣緩沖液100 μL，100℃煮沸8 min。配制16.5%的分離膠和夾層膠、濃縮膠，30 V 電壓預電泳 10 min，再加入 20 μL 樣品，30 V電壓電泳60 min，然后100 V 電壓電泳至溴酚藍到達底部。電泳結束后，將Tricine-SDS-PAGE 膠放入燒杯中，加入考馬斯亮藍染色液，覆蓋膠面，放置在水平搖床上染色過夜，倒出染色液，加入脫色液脫色4～6 h，加入去離子水浸泡，拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19 統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析，實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗，P＜0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PADM/RV-23復合材料具有較高的抗菌活性

由圖1可以看出，PADM 和 PADM/RV-23 復合材料對細菌都有不同程度的抑制作用。隨著RV-23 濃度的升高，PADM/RV-23 復合物實驗組細菌存活越來越低，當RV-23 濃度為20 μmol/L時，細菌存活僅為（0.59±1.15）%，提示RV-23 復合PADM 后仍然具有較好的抗菌效果。

2.2 PADM/RV-23復合材料具備較低的溶血能力

據(jù)報道，抗菌肽在細菌細胞膜上打孔致使細胞破裂、死亡[15]，因此我們檢測了PADM/RV-23 復合材料對紅細胞的溶血能力，發(fā)現(xiàn)PADM 可以降低RV-23的溶血活性。無論復合材料還是RV-23 組，隨著抗菌肽RV-23 濃度的升高，溶血活性都會提高，但同濃度相比，復合材料組的溶血活性低于RV-23 組（圖2）。

以上結果提示，PADM 對RV-23的溶血性能具有很好的屏蔽作用，很大程度地減弱了抗菌肽RV-23 對真核紅細胞膜的溶破作用。

2.3 PADM/RV-23復合材料對上皮細胞無副作用

圖1 PADM/RV-23復合材料顯著抑制細菌生長

由于PADM 敷料基本應用于傷口創(chuàng)面，我們檢測了PADM/RV-23 復合材料對人表皮角化細胞HaCaT 和鼠成纖維細胞NIH-3T3的影響，結果發(fā)現(xiàn)RV-23 對2 種細胞的毒性隨著濃度的升高而增加，PADM/RV-23 復合材料基本不影響HaCaT 和NIH-3T3的增殖（圖3）。例如，對于HaCaT 細胞，RV-23 濃度為 20 μmol/L 時 PR20 組細胞活性為（103.97 ± 2.33）% ，單獨RV-23組為（37.46 ±4.27）%。對于NIH-3T3 細胞，也取得類似結果。

2.4 PADM/RV-23復合材料性質穩(wěn)定

將制備的復合材料室溫保存1 個月，然后進行Tricine-SDS-PAGE，檢測RV-23 是否降解。結果見圖4，當PADM/RV-23 復合材料所含RV-23抗菌肽濃度分別為1、5 和20 μmol/L 時都有明顯條帶，說明該復合材料室溫放置1 個月后RV-23仍然沒有降解，提示該復合材料較穩(wěn)定。

圖2 PADM/RV-23復合材料對紅細胞的溶血作用

圖3 PADM/RV-23復合材料對上皮細胞的毒性

圖4 抗菌肽RV-23的Tricine-SDS-PAGE

3 討論

豬皮結構與人皮膚結構相似，具有保持傷口濕潤環(huán)境、減少疼痛、促進痊愈、減少瘢痕形成等作用，可用于深度燒傷的治療，但其臨床應用的最大障礙是異種免疫排斥反應。脫細胞制備PADM 過程中，去除了大部分異種抗原，大大降低了免疫排斥反應。同時，PADM 保留了完整的膠原三維結構，不僅為再生修復提供支架，還可以調節(jié)細胞的遷移、增殖、分化，加快傷口愈合[16-17]，因此廣泛用于創(chuàng)傷、燒傷治療以及整形美容等領域[18]。目前市場上的PADM 有α-Gal 抗原，免疫原性高。為此，我們實驗室用α-半乳糖苷酶清除PADM 上的α-Gal 抗原，制備了免疫原性更低、生物相容性更好的PADM。

感染是影響創(chuàng)面愈合的重要因素，而耐藥菌感染不僅延誤創(chuàng)傷治療，而且有可能危及患者生命。在本研究中，我們將抗菌肽RV-23 和低免疫原PADM 結合，制備了PADM/RV-23 復合材料，評價其抗菌性、溶血性以及對HaCaT 和NIH-3T3 細胞的毒性。結果發(fā)現(xiàn)，該復合物在保留了較強抑菌作用的同時，還具備紅細胞的溶血作用較低，對上皮細胞、成纖維細胞無毒性等優(yōu)點，性質穩(wěn)定，作為新型抗菌敷料具有良好的使用價值和開發(fā)前景。