倪艷麗，李昀橋 ，蘭雨，劉兵

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100071；3.暨南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和多向分化的潛能，持續(xù)不斷產(chǎn)生機(jī)體所需的各類血細(xì)胞。小鼠胚胎發(fā)育早期，第一波原始造血起源于胚胎期第7.25 d（E7.25）卵黃囊區(qū)域的造血祖細(xì)胞，其快速產(chǎn)生有核原始紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種功能細(xì)胞。緊隨其后，E8.25的卵黃囊血管產(chǎn)生了第二波短暫的永久造血祖細(xì)胞——紅髓系祖細(xì)胞（erythro-my?eloid progenitor，EMP）。EMP 可遷移至小鼠胎肝，并具有分化為成熟紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的能力。卵黃囊產(chǎn)生的原始造血細(xì)胞對(duì)于小鼠胚胎期的生存不可或缺，并極大地貢獻(xiàn)了成體時(shí)期不同組織中的駐留型免疫細(xì)胞[1]。直至E10.5，第三波最為重要的定向造血以產(chǎn)生第一個(gè)具有長(zhǎng)期重建成體造血系統(tǒng)潛能的HSC 為標(biāo)志。HSC 可起源于胚胎體多個(gè)血管部位，包括主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonadmesonephros，AGM）區(qū)、頭部、胎盤(pán)和卵黃囊[2-3]。研究顯示，AGM 區(qū)是HSC 生成的最主要位點(diǎn)，其產(chǎn)生的HSC 遷移至胎肝擴(kuò)增，并于新生后歸巢骨髓，貢獻(xiàn)著機(jī)體終生造血活動(dòng)。

造血干祖細(xì)胞的起源一直是造血發(fā)育研究的熱點(diǎn)。利用小鼠內(nèi)皮示蹤研究策略，發(fā)現(xiàn)EMP群體起源于卵黃囊血管中的少部分內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)HSC 也起源于主動(dòng)脈血管中的少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞，提示內(nèi)皮細(xì)胞是造血祖細(xì)胞的前體[4-5]。2010年，Traver 和Robin 研究團(tuán)隊(duì)分別通過(guò)實(shí)時(shí)成像技術(shù)更直觀地發(fā)現(xiàn)AGM 區(qū)主動(dòng)脈腹側(cè)的一群特化的血管內(nèi)皮細(xì)胞以出芽的形式形成含有造血干祖細(xì)胞的造血簇，因此該過(guò)程被稱為內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化（endothelial to haematopoietic transition，EHT），這部分特化的內(nèi)皮細(xì)胞被定義為生血內(nèi)皮細(xì)胞（hemogenic endothelial cell，HEC）[6-7]。直至最近，de Bruijn 和Dzierzak 團(tuán)隊(duì)分別利用Runx1+23GFP和Ly6a-GFP 小鼠模型標(biāo)記并分離生血HEC，并初步嘗試揭示其分化規(guī)律及分子特征[8-9]。然而迄今仍無(wú)有效的表面分子進(jìn)行HEC的有效富集，使得相關(guān)研究停滯不前。

我們研究團(tuán)隊(duì)采用單細(xì)胞孵育誘導(dǎo)移植策略結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志CD201的特異性高表達(dá)，首次實(shí)現(xiàn)了EHT 過(guò)程中關(guān)鍵細(xì)胞群體——HSC 前體的高效捕獲，并在單細(xì)胞水平揭示了其分子表達(dá)規(guī)律，為精準(zhǔn)富集和研究生血內(nèi)皮群體提供了重要的范式[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用流式Index Sorting 新技術(shù)鑒定小鼠胚胎HEC的表面標(biāo)志分子表達(dá)特征，并結(jié)合體外孵育實(shí)驗(yàn)及免疫組化染色技術(shù)驗(yàn)證HEC的造血分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL 純品系小鼠購(gòu)自斯貝福生物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)在軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為無(wú)特異性病原菌環(huán)境（specific pathogen free，SPF），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)為SYXK（軍)2012-0021。

小鼠 FACS 抗體 CD31（MEC13.3）、CD43（S7）均購(gòu)自 BD Biosciences 公司；CD41（MWReg30）、CD45（30-F11）、Kit（2B8）和 CD47（miap301）均購(gòu)自eBioscience 公司；7-氨基放線菌素D（7-amino-actinomycin D，7-AAD）購(gòu)自Invitrogen 公司；重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（rhVEGF-165）、小鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）均購(gòu)自Peprotech 公司；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、IMDM 培養(yǎng)基均購(gòu)自Hyclone 公司；Ⅰ型膠原酶、牛血清白蛋（BSA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白均購(gòu)自Sigma 公司；巰基乙醇購(gòu)自Gibco 公司；胰島素購(gòu)自Macgene 公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf 5804R）購(gòu)自Eppendorf 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma K3111）購(gòu)自 Thermo 公司；解剖鏡（Leica S8APOLZ）購(gòu)自萊卡公司；48 孔培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿（Costar）、流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD 公司。

1.2 小鼠AGM區(qū)組織解剖

雄鼠與雌鼠合籠后，次日中午雌鼠陰道口檢出精栓記為E0.5，d10（體節(jié)數(shù)為30～34 個(gè)）時(shí)解剖取出小鼠胚胎，在解剖鏡下分離胚胎組織；孕鼠取出孕囊后，從兩側(cè)子宮角用鑷子撕開(kāi),剝離胎盤(pán)，獲得由卵黃囊包裹的胚胎；截去臍血管與卵黃血管后，從胚胎體的上下肢芽間截?cái)啾臣箓?cè)，去除原腸后獲得含有胚胎AGM 區(qū)的組織，隨后輕輕鈍性分離AGM 區(qū)。

1.3 單細(xì)胞懸液制備

1.3.1 AGM 組織消化 0.1%的Ⅰ型膠原酶于37℃消化25 min，用含10%血清的IMDM 培養(yǎng)基中和，4℃、310 r/min 離心6 min，棄上清后重懸獲得單細(xì)胞懸液。

1.3.2 流式分析和分選 將單細(xì)胞化后的細(xì)胞用含2%血清的PBS 清洗1 次，按照抗體說(shuō)明書(shū)推薦量添加抗體，4℃混懸孵育抗體30 min。用含2%血清的PBS 洗1 次，標(biāo)記7-AAD，室溫孵育5 min，加入一定體積的含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 稀釋細(xì)胞溶液后，流式細(xì)胞儀分析或分選。

1.4 OP9-DL1基質(zhì)細(xì)胞共孵育

OP9-DL1 細(xì)胞提前 24 h 鋪到 48 孔板，分選之前更換加入含15%胎牛血清（FBS）、1% BSA、10 mg/mL 胰島素、200 mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、10-4mol/L 巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、100 ng/mL rhVEGF-165 和50 ng/mL SCF的IMEM 溶液，流式細(xì)胞儀分選單個(gè)目的細(xì)胞至鋪好OP9-DL1 細(xì)胞的48 孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱于37℃孵育7 d，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 免疫組化染色

單細(xì)胞與OP9-DL1 細(xì)胞孵育7 d 后棄上清，用適量2%多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞15～20 min。①內(nèi)皮細(xì)胞染色：固定后PBS 清洗1 次，孵育CD31 一抗4℃過(guò)夜，次日回收一抗，孵育辣根過(guò)氧化物酶二抗標(biāo)記30 min，之后用DAB 顯色（藍(lán)色）；②造血細(xì)胞染色：內(nèi)皮染色后PBS 清洗3次，孵育CD45 一抗4℃過(guò)夜，次日回收一抗，孵育辣根過(guò)氧化物酶二抗標(biāo)記30 min，之后用DAB 顯色（棕色）。顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)具有造血和內(nèi)皮潛能的孔數(shù)，采集照片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)使用Flowjo7.6.1 軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用Graphpad 軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞Index Sorting原理及使用

流式細(xì)胞Index Sorting 技術(shù)是一種全新的單細(xì)胞分選模式，在分離單細(xì)胞的同時(shí)，可以讀取并存儲(chǔ)每個(gè)細(xì)胞的所有蛋白熒光表達(dá)值和細(xì)胞散射參數(shù)特征。結(jié)合單細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)或單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)，借助強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)和分析能力，可追溯分析每個(gè)目的細(xì)胞所獨(dú)有的特征參數(shù)[11]。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：①同時(shí)記錄高達(dá)數(shù)十種細(xì)胞特征參數(shù)，在數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞中可精準(zhǔn)定位單個(gè)目的細(xì)胞，重復(fù)性好；②對(duì)于探索免疫表型未知的細(xì)胞群體具有極強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

與以往單細(xì)胞分選技術(shù)相比，Index Sorting 技術(shù)較為完美地將單細(xì)胞流式分選、單細(xì)胞功能驗(yàn)證和單細(xì)胞組學(xué)有效結(jié)合在一起，使之成為一整套研究方案。目前單細(xì)胞Index sorting 技術(shù)較多應(yīng)用于造血和免疫系統(tǒng)研究，而在其他研究領(lǐng)域應(yīng)用才剛剛開(kāi)始[12]。

本研究中，我們首先對(duì)BD ArialⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行軟硬件升級(jí)改造，使之符合6～384 孔板分選操作的需求。BD ArialⅡ加裝單細(xì)胞分選硬件模塊的同時(shí)，升級(jí)操作至DIVA8 版本，同時(shí)擴(kuò)展相應(yīng)的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)空間和內(nèi)存以保證流式軟件流暢運(yùn)行。結(jié)果如圖1顯示，以48 孔板分選為例，操作界面右下方紅框內(nèi)為Index Sorting 選項(xiàng)，界面下方為分選目的細(xì)胞群體門(mén)及單細(xì)胞分選方式，界面上方顯示并記錄48 孔中每個(gè)細(xì)胞的流式特征參數(shù)。后續(xù)通過(guò)每個(gè)孔的單細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，可追溯目的細(xì)胞所在流式群體門(mén)的位置，并直觀標(biāo)記在流式結(jié)果圖上。

2.2 Kit+內(nèi)皮細(xì)胞具有生血潛能

采用建立的單細(xì)胞Index Sorting 新技術(shù)，我們計(jì)劃更精細(xì)地分析小鼠E10 AGM 區(qū)的HEC 群體。已有研究表明HEC 表達(dá)經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞表面分子CD31 和CD144（VE-cadherin），不表達(dá)公認(rèn)的造血表面分子CD45、CD41 和CD43 等。Kit（CD117）作為成體小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞表面標(biāo)志，也可用于富集小鼠E11 AGM 區(qū)pre-HSC。提示應(yīng)用 Kit 富集 HEC的可行性[13]。

流式分析表明CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+在小鼠E10 AGM 細(xì)胞中的比率約為3%（圖2A、B）。流式分選單個(gè)CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+細(xì)胞，與基質(zhì)細(xì)胞OP9-DL1 共孵育誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行免疫組化染色，約12%（49/416）的細(xì)胞生成CD31+內(nèi)皮管狀結(jié)構(gòu)，約31%（129/416）的細(xì)胞可產(chǎn)生CD45+造血細(xì)胞簇，提示具有生血潛能（圖2C、D）。這部分研究結(jié)果同時(shí)表明，60%以上的Kit+細(xì)胞不具備生血或生內(nèi)皮功能（圖2E），提示仍須進(jìn)一步探索富集HEC 表面分子。

2.3 表面分子CD47顯著富集生血內(nèi)皮細(xì)胞

我們前期研究發(fā)現(xiàn)表面分子CD47 部分表達(dá)在AGM 區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞及pre-HSC 上，分別通過(guò)富集CD47-和CD47+的內(nèi)皮和pre-HSC，經(jīng)體外誘導(dǎo)孵育結(jié)合小鼠移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有HSC 活性的細(xì)胞均富集在CD47+細(xì)胞群體中，提示CD47 可進(jìn)一步用于標(biāo)記發(fā)育階段更早的HSC 相關(guān)群體。例如，在單細(xì)胞水平，它是否能識(shí)別具有生血潛能的HEC，而近期的研究表明AGM 區(qū)的造血祖細(xì)胞和HSC 均來(lái)源于HEC。

為了證實(shí)這一結(jié)論，應(yīng)用流式細(xì)胞Index Sorting 技術(shù)的可回溯性功能，即在上述分選群體標(biāo)志的基礎(chǔ)上同時(shí)標(biāo)記CD47 分子，后續(xù)根據(jù)體外孵育培養(yǎng)的結(jié)果，可以追溯我們關(guān)注的重要細(xì)胞群體的CD47 分子的表達(dá)情況。分析發(fā)現(xiàn)，CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+的內(nèi)皮細(xì)胞群體中，約60%的細(xì)胞表達(dá)CD47。此外，具有生內(nèi)皮、生血潛能的CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+細(xì)胞均富集在CD47+的細(xì)胞群體（圖3A、B）。該結(jié)果提示CD47表達(dá)可將HEC 群體的精度顯著提高1.5 倍（圖3B）。

圖1 48孔板單細(xì)胞Index Sorting分選操作界面

根據(jù)體外孵育誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD47 陽(yáng)性的內(nèi)皮群體中仍有60%以上不具備生內(nèi)皮或生血能力，表明未來(lái)須通過(guò)我們已建立的流式細(xì)胞Index Sorting 技術(shù)繼續(xù)發(fā)掘HEC的新表面標(biāo)志分子，以進(jìn)一步提高富集HEC的精度。

3 討論

生血內(nèi)皮群體是內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化過(guò)程中極為重要的關(guān)鍵群體，因其數(shù)量極其稀少、命運(yùn)轉(zhuǎn)化時(shí)間窗口短暫、分子表型特征不明等因素，使得目前仍無(wú)有效手段去精準(zhǔn)定位及富集該類細(xì)胞?，F(xiàn)有研究提示，胚胎時(shí)期AGM 區(qū)主動(dòng)脈血管內(nèi)皮通過(guò)形成造血簇的方式產(chǎn)生造血干細(xì)胞的過(guò)程中還存在2 類造血干細(xì)胞前體。我們前期利用創(chuàng)新的單細(xì)胞孵育移植技術(shù)結(jié)合CD201 分子的特異性高表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了造血干細(xì)胞前體高達(dá)30%的精度富集，本研究則進(jìn)一步提供了全新的干細(xì)胞發(fā)育研究思維和范式。單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用和開(kāi)發(fā)中方法學(xué)的創(chuàng)新，將極大地推動(dòng)造血干細(xì)胞發(fā)育研究領(lǐng)域的進(jìn)展。因此，本研究建立了單細(xì)胞Index Sorting 技術(shù)，并探索尋找發(fā)育時(shí)間更早、表型更不明確的生血內(nèi)皮群體。

同時(shí)，前期積累的大量造血干細(xì)胞發(fā)育全程的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步發(fā)掘并富集出生血內(nèi)皮群體提供了重要線索，如本研究發(fā)現(xiàn)Kit、CD47、CD201 等均能有效富集出具有生血潛能的內(nèi)皮。這些研究基礎(chǔ)將為后續(xù)進(jìn)一步探索生血內(nèi)皮提供重要的數(shù)據(jù)支持。綜上，我們建立了單細(xì)胞Index Sorting 技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)具有造血潛能的生血內(nèi)皮均富集在CD47+的內(nèi)皮細(xì)胞群體中，CD47 分子將生血內(nèi)皮群體的精度顯著富集了1.5 倍以上。

圖2 OP9-DL1共培養(yǎng)后48孔板中單個(gè)CD41-CD43-CD45-CD31+KIT+細(xì)胞的分化潛能

圖3 Index Sorting分析CD47富集HEC