梁皓，肖向茜，盛望

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

2017年是嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法的突破元年，先后有2 款CAR-T 細(xì)胞療法經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，用于急性淋巴細(xì)胞白血病和復(fù)發(fā)性或難治性大B 細(xì)胞淋巴瘤[1-2]。雖然CAR-T 細(xì)胞有良好的應(yīng)用前景，但同時(shí)存在許多不足之處。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞作為另一種重要的腫瘤殺傷性免疫細(xì)胞，在CAR的應(yīng)用中具有T 細(xì)胞沒有的一些優(yōu)勢：異體NK 細(xì)胞不會引起移植物抗宿主反應(yīng)（graft-versus-host disease，GVHD），并已在許多臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)[3-4]；NK 細(xì)胞不分泌引起細(xì)胞因子釋放綜合征的炎癥因子，如IL-1、IL-6等[5]；CAR-NK 細(xì)胞除了CAR 介導(dǎo)的靶向殺傷之外，還可以通過NK 細(xì)胞自身抗腫瘤的特性，識別并殺傷CAR 靶標(biāo)下調(diào)或缺失的腫瘤細(xì)胞，提高免疫治療效果[6]；NK 細(xì)胞來源豐富，包括外周血（peripheral blood，PB）、臍帶血（umbilical cord blood，UCB）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPCS）、NK-92 等細(xì)胞系[7-9]，使其能成為一種“現(xiàn)貨（off the shelf）”細(xì)胞產(chǎn)品。在此，我們簡要綜述近年來CARNK 細(xì)胞在免疫治療中的進(jìn)展。

1 NK細(xì)胞簡介

NK 細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的10%～15%[10]，根據(jù)CD16 與CD56的表達(dá)情況可分為CD56brightCD16-和CD56dimCD16+等 2 種 NK 細(xì)胞[11]，它們在表型、組織分布和免疫效果上各不相同。CD56dim細(xì)胞在外周血中占NK 細(xì)胞總量的90%，它們是完全成熟的NK 細(xì)胞，在免疫殺傷中占主導(dǎo)地位。由于CD56dim細(xì)胞表達(dá)Fcγ受體CD16，它可以發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[12]。與之相比，CD56bright細(xì)胞未完全成熟，它們主要負(fù)責(zé)細(xì)胞因子的分泌，具有較弱的細(xì)胞毒性。CD56bright細(xì)胞在外周血中含量較少，在二級淋巴器官中含量較高，說明可能具有更好的滲透性，易于穿過血管到達(dá)組織中[13]。

2 NK細(xì)胞的來源

用于臨床治療的NK 細(xì)胞有多種來源，盡管自體NK 細(xì)胞可應(yīng)用于細(xì)胞過繼治療中，但它在臨床中治療腫瘤的效果有限[14]，所以CAR 應(yīng)用于異體來源的NK 細(xì)胞中會更有前景。異體NK 細(xì)胞的來源包括外周血、NK 細(xì)胞系、臍帶血、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等（表1）。

2.1 外周血

NK 細(xì)胞可以從人的外周血中通過血漿分離置換法分離出來[15]，由于其在外周血中所占比例較低，通常需要在體外擴(kuò)增以達(dá)到臨床使用的數(shù)量。通過添加IL-2 和飼養(yǎng)細(xì)胞（提前輻照過的轉(zhuǎn)染EB 病毒的淋巴細(xì)胞系），NK 細(xì)胞得到大量擴(kuò)增[16]。另一種方法是用轉(zhuǎn)染4-1BB 配體和mbIL-15的HLA 缺陷型K562 細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞在體外擴(kuò)增NK 細(xì)胞[17]。飼養(yǎng)細(xì)胞的存在可能會增加NK 細(xì)胞在臨床中的副作用[18]，所以無飼養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增技術(shù)相繼發(fā)展。Wagner 等利用兩步法技術(shù)，在IL-15 和IL-21的幫助下得到大量具有殺傷活性的NK 細(xì)胞[19]。

目前已有多項(xiàng)關(guān)于外周血來源的CAR-NK 細(xì)胞用于癌癥免疫治療的研究，其中靶向CD19 最為突出，修飾后的CAR-NK 細(xì)胞在急性B 淋巴細(xì)胞白血病的治療中具有十分理想的療效[29-30]。對于實(shí)體瘤的治療，研究人員開發(fā)了多種靶向腫瘤相關(guān)抗原的 CAR-NK 細(xì)胞，如靶向 GD2、EGFR 和PSCA 等[29-31]。經(jīng)過 CAR 修飾后的 NK 細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。其中，最為特別的是以NKG2D 作為胞外域的CAR結(jié)構(gòu)[32]，NKG2D 可以與多種腫瘤表面的配體結(jié)合，有廣譜抗癌效果，NKG2D-DAP10-CD3ζ構(gòu)建的CAR-NK 細(xì)胞對于骨肉瘤、前列腺癌、橫紋肌瘤等腫瘤有著良好的殺傷效果。

2.2 NK細(xì)胞系

與外周血來源的NK 細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞系具有許多優(yōu)勢，便捷的擴(kuò)增方式和均一的表型使其最有希望成為“現(xiàn)貨”細(xì)胞產(chǎn)品。目前已建立了多種NK細(xì)胞系，如NK-92、YTS、KHYG-1 等，其中對NK-92細(xì)胞的研究最為廣泛。NK-92 細(xì)胞是1992年從一位非霍奇金淋巴瘤病人體內(nèi)分離得到的[39]，表型為CD56brightCD16-NKG2A+KIR-（除 KIR2DL4）[40-41]。臨床試驗(yàn)證明NK-92 細(xì)胞具有良好的生物安全性，即使病人注射了1010/m2的NK-92 細(xì)胞，仍未觀察到明顯的副作用[42-44]。NK-92 細(xì)胞是目前惟一被FDA 批準(zhǔn)用于臨床治療的NK 細(xì)胞系，但臨床療效有限，所以導(dǎo)入CAR 提高NK-92 細(xì)胞的治療效果十分必要。近幾年，不同研究組用NK-92 細(xì)胞表達(dá)多種CAR 用于白血病與實(shí)體瘤的研究[33-38]，如靶向CD19的細(xì)胞用于治療淋巴瘤和白血病，靶向CS-1的細(xì)胞用于治療多發(fā)性骨髓瘤，靶向EGFR的細(xì)胞用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，靶向EpCAM的細(xì)胞用于治療乳腺癌，靶向GPC3的細(xì)胞用于治療肝細(xì)胞癌等。盡管NK-92 細(xì)胞吸引了很多研究者的目光，其自身也存在諸多缺點(diǎn)。由于NK-92 細(xì)胞來源于非霍奇金淋巴瘤病人，為了安全性考慮，在臨床應(yīng)用中NK-92 細(xì)胞須提前接受輻射照射，因此大大降低了其在體內(nèi)的持續(xù)性與有效性[45]。同時(shí)，NK-92 細(xì)胞激活與增殖需要依賴IL-2，在臨床應(yīng)用中系統(tǒng)性的IL-2 給藥有很嚴(yán)重的副作用，并且會激活免疫抑制信號[46]。此外，NK-92 細(xì)胞表面缺乏多種激活性受體，如NKp44和NKp46，且不表達(dá)CD16，無法引起ADCC[47]。

2.3 臍帶血

臍帶血來源的NK 細(xì)胞復(fù)蘇后即可使用，無須考慮如NK 細(xì)胞系所存在的安全性隱患，使它同樣擁有成為一種“現(xiàn)貨”細(xì)胞產(chǎn)品的潛力。臍帶血中的NK 細(xì)胞比列（15%～20%）與NK 細(xì)胞在外周血中的比例類似[48]，由于一份臍帶血的容量較少，使得從中獲得足夠數(shù)量的NK 細(xì)胞用于臨床治療成為一項(xiàng)難題。靜息狀態(tài)的臍帶血NK 細(xì)胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，其表面高表達(dá)抑制性受體NKG2A 并低表達(dá)激活性受體如 NKp46、NKG2C 和DNAM-1 等[49]。為了克服這些缺陷，Shah 等使用細(xì)胞膜表面表達(dá)IL-21 和4-1BB 配體的GMP 級K562 細(xì)胞作為人工提呈細(xì)胞，使一份臍帶血可以產(chǎn)生足夠臨床免疫治療的NK 細(xì)胞用量[50]。通過體外激活，臍帶血NK 細(xì)胞最終可以表達(dá)出完整的激活性受體與抑制性受體，達(dá)到與外周血中NK 細(xì)胞相似的細(xì)胞毒性[51-52]。

2.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

iPSC 衍生出的NK 細(xì)胞同時(shí)擁有外周血NK細(xì)胞和NK 細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)，它不僅性質(zhì)均一可以大量擴(kuò)增，而且無須輻照即可注入體內(nèi)。iPSC 可以輕易地從皮膚或外周血中獲取，一旦轉(zhuǎn)化后便可在體外無限擴(kuò)增[53]。目前的證據(jù)表明，對于卵巢癌細(xì)胞系 MA148 和 A1847，iPSC-NK 細(xì)胞比外周血NK 細(xì)胞展現(xiàn)了更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用[54]。CAR-iPSC-NK 已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可行，并顯示出很好的腫瘤清除效果[38]。

3 CAR-NK細(xì)胞在臨床治療中的應(yīng)用

目前已有14 項(xiàng)關(guān)于CAR-NK的臨床試驗(yàn)，其中中國 5 項(xiàng)、美國 3 項(xiàng)、新加坡 1 項(xiàng)、德國 1 項(xiàng)，Allife 醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)有限公司資助的4 項(xiàng)臨床試驗(yàn)處于早期Ⅰ期，未提供相關(guān)的詳細(xì)資料，無法統(tǒng)計(jì)（未列出）。這些臨床試驗(yàn)多集中于血液腫瘤研究，占9 項(xiàng)，剩余6 項(xiàng)嘗試解決CAR-T 未能解決的實(shí)體瘤。圣猶德兒童研究醫(yī)院完成了第一個(gè)關(guān)于CAR-NK的臨床Ⅰ期試驗(yàn)（NCT00995137），這項(xiàng)研究使用靶向CD19的CAR-NK 細(xì)胞治療B 系急性淋巴細(xì)胞白血病。NK細(xì)胞來源于供者外周血，表達(dá)IL-15 和4-1BB 膜結(jié)合配體的K562 細(xì)胞系經(jīng)輻照后作為飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增PB-NK細(xì)胞。隨后在NK細(xì)胞中導(dǎo)入CAR結(jié)構(gòu)（Anti-CD19+4-1BB+CD3ζ），再將其注射到病人體內(nèi)，目前相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果尚未公開。在另一項(xiàng)使用PB-NK的研究中（NCT03415100），廣譜性 CAR-NK（靶向NKG2D 配體）首次應(yīng)用于臨床，用于治療多種轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤。使用NK-92 細(xì)胞系與臍帶血來源NK 細(xì)胞的臨床試驗(yàn)也在同步展開。博生吉醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司是中國最早使用NK-92 細(xì)胞進(jìn)行CARNK 研究的機(jī)構(gòu)，目前有4 項(xiàng)分別靶向CD19、CD7、CD33 和MUC1的臨床試驗(yàn)正在開展。MD 安德森癌癥中心開展2 項(xiàng)臍帶血來源的CAR-NK 細(xì)胞用于治療B 細(xì)胞淋巴瘤。2 項(xiàng)試驗(yàn)的區(qū)別在于是否伴隨高劑量化療與骨髓移植，使用的CAR 結(jié)構(gòu)是相同的。他們不僅導(dǎo)入了包含Anti-CD19+CD28+CD3ζ的CAR結(jié)構(gòu)，還導(dǎo)入了作為自殺基因的iCasp9 與增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的IL-15 基因。CAR-NK 細(xì)胞臨床試驗(yàn)匯總見表2。

表2 CAR-NK細(xì)胞臨床試驗(yàn)

4 CAR-NK細(xì)胞存在的挑戰(zhàn)

盡管CAR-NK 細(xì)胞具有許多優(yōu)勢，但在目前的臨床應(yīng)用中仍存在著一些挑戰(zhàn)。首先的障礙是轉(zhuǎn)染方式的選擇。目前的轉(zhuǎn)染方式主要分為病毒載體和非病毒載體。對于病毒載體而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率很高[55]，但這種方法會引發(fā)隨機(jī)插入突變的發(fā)生，有一定概率的致瘤性；相對而言，慢病毒載體的插入溫和一些，引入突變的概率較低，但其轉(zhuǎn)染效率有待改善。為了克服病毒載體插入突變的問題，非病毒載體轉(zhuǎn)染方式受到了關(guān)注。但常用的電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染的CAR 結(jié)構(gòu)不會整合進(jìn)入基因組，只能短暫表達(dá)，持續(xù)3 d 左右[21]。隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，已開發(fā)出多種可以使外源基因穩(wěn)定表達(dá)的編輯技術(shù)，如睡美人轉(zhuǎn)座子、TALEN、CRISPR 等[56]，有望在今后將這些技術(shù)應(yīng)用于CAR-NK 細(xì)胞的構(gòu)建。此外，NK 細(xì)胞的生命周期短暫，NK-92 細(xì)胞系在使用前需要輻照，這些特點(diǎn)避免了持續(xù)殺傷含有腫瘤相關(guān)抗原的正常細(xì)胞，但也影響了CAR-NK 細(xì)胞治療的有效性。

5 結(jié)語

我們正處于細(xì)胞治療快速發(fā)展的元年，人類終于看到了戰(zhàn)勝腫瘤的希望。但是，仍然有許多問題等待著我們。相對于CAR-T的巨大成功，NK 細(xì)胞在理論上存在的優(yōu)勢是否在臨床試驗(yàn)中能夠得以驗(yàn)證，成為另一種便捷有效的即用型細(xì)胞產(chǎn)品，補(bǔ)充甚至是替代CAR-T 呢？另外，CARNK 目前面臨的許多問題，如NK 細(xì)胞來源選擇、CAR 結(jié)構(gòu)的取舍、轉(zhuǎn)染方式的改善等，都需要得到解決。相信隨著理論知識的完善，臨床研究的進(jìn)行和聯(lián)合治療的發(fā)展，CAR-NK 細(xì)胞的治療方法在今后必然會占據(jù)一方舞臺。