周良燚，陳金琴，余碩，陳必鏈，戴秋云

1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)院，福建 福州 350117；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

芋螺毒素是由芋螺毒腺分泌的一類活性短肽，通常由12～40 個氨基酸殘基組成，富含二硫鍵。根據(jù)其保守的信號肽序列和半胱氨酸框架，芋螺毒素可分為A、M、O、P、S、T、I、V、Y、J 等 20多個超家族[1-2]；根據(jù)其藥理學(xué)靶點的不同，芋螺毒素又可分為α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、加壓素、驚厥劑、睡眠肽等藥理家族[3-4]。ω-芋螺毒素由24～29個氨基酸殘基組成，含3 對二硫鍵，半胱氨酸骨架結(jié)構(gòu)為C-C-CC-C-C，二硫鍵連接方式為C1-C4、C2-C5、C3-C6[5]，主要作用于 N、P/Q 及 L 型鈣離子通道[2,6-7]。類似ω-芋螺毒素半胱氨酸骨架結(jié)構(gòu)的還有δ、μO、κ及γ家族芋螺毒素，分別作用于鉀離子通道（如κ-PⅦA[8]）、鈉離子通道（如μO-MrⅥB[9]）、nAChR（如δ-TxⅥA[10]）等。

N 型鈣離子通道與疼痛位點的信息傳遞密切相關(guān)[11]。2004年美國上市的第1 個ω-芋螺毒素鎮(zhèn)痛藥物MⅦA 對晚期癌癥、神經(jīng)疼等有效,但其具有嚴(yán)重的副作用，如眩暈、行走失禁、幻想、震顫等癥狀，影響了其用藥適從性[12-14]。本實驗室發(fā)現(xiàn)的SO-3 對N 型鈣離子通道的抑制作用和MⅦA相當(dāng)，且SO-3 對金魚的毒性顯著低于MⅦA，對小鼠的行動影響也低于MⅦA[14]，目前SO-3 已經(jīng)完成了臨床前研究試驗。為發(fā)現(xiàn)新的N 型鈣離子通道的抑制劑，提供活性高、副作用低的鎮(zhèn)痛分子，我們合成了來自泡芋螺（Conus bullatus）的2 種新型ω-芋螺毒素 Bu1（序列 CKGPGAKCLKT?MYDCCKYSCSRGRC-NH2）及Bu13（序列CKGPGA?SCIRIAYNCCKYSCRNGKC-NH2）[15]，并測定其作用靶標(biāo)。結(jié)果表明，Bu1 和Bu13 選擇性作用于N 型鈣離子通道。該工作為設(shè)計新型N 型鈣離子通道抑制劑提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T 細胞（ATCC）；鼠源電壓門控鈣通道質(zhì)粒（α1B、α1A、α1C、α2δ1、β3）、eGFP（本實驗室保存）；Fmoc-氨基酸、HOBT、HBTU（上海吉爾生化公司）；DIEA（北京伊諾凱科技有限公司）；Rink 樹脂（天津南開和成科技有限公司）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA、Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco 公司）；LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen 公司）；BaCl2·2H2O、MgCl2·2H2O、CsCl、NaCl、HEPES、CsOH 水溶液、N-甲基-D-葡萄糖胺（Sigma 公司）；其他試劑均為分析純。

Sophas 多肽合成儀（Zinsser Analytic 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；微電極拉制儀（P-97，Sutter 公司）；數(shù)模轉(zhuǎn)換器（DigiData 1440A）、放大器（Multiclamp 700B）（Molecular De?vices 公司）；微操縱儀（MP-285，Sutter 公司）；放大器（Axoclamp 900B，Molecular Devices 公司）；倒置熒光顯微鏡（IX-71，Olympus 公司）；多通道灌流設(shè)備（MPS-2，武漢華中儀博公司）；細胞灌流槽（RC-24N，Warner Instruments 公司）；恒流蠕動泵（保定蘭格公司）。

1.2 線性肽的合成、折疊、富集和純化

采用固相法合成[6]。稱取0.05 mmol Rink 樹脂，配制0.3 mmol Fmoc-氨基酸、偶合劑（0.6 mol/L HOBT、HBTU）、DIEA 及脫保護劑（30%哌啶），用Sophas 多肽合成儀合成，得到肽樹脂。

肽樹脂中加入裂解液（0.25 g DTT，0.2 mL三異丙基硅烷，0.25 mL H2O，4.4 mL TFA），攪拌3 h，過濾，旋去大部分TFA，加入無水乙醚，沉淀多肽，G4 漏斗過濾收集多肽。

線性肽（約50 mg）溶于200 mL 折疊液（0.5 mol/L NH4Ac，1 mmol/L 谷胱甘肽，0.1 mmol/L 氧化谷胱甘肽，pH 值調(diào)至 8.0～8.2）中，4℃折疊 24～48 h，HPLC 監(jiān)測折疊進程。折疊完成后用乙酸調(diào)節(jié)pH 值為4.5，終止反應(yīng)。用反相制備柱富集，反相半制備柱純化，得到目標(biāo)肽。多肽送北京蛋白質(zhì)組研究中心進行質(zhì)譜鑒定。

1.3 圓二色譜測定

多肽溶于0.01 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.2），濃度為 35 μmol/L。室溫下，采用 Chirascan Plus 圓二色光譜儀（應(yīng)用光物理公司）進行測定，λ=190～260 nm，d=1 mm，空白對照為0.01 mol/L 磷酸緩沖液，重復(fù)測定3 次。

1.4 全細胞膜片鉗檢測多肽對鈣離子通道的抑制活性

將鼠源鈣通道質(zhì)粒（α1、α2δ1、β3，各1 μg）及eGFP（0.2 μg）（其中N 型鈣通道的α1 亞基為α 1B，P/Q 型鈣通道的為α1A，L 型鈣通道的為α1C）用 LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染至 HEK293T 細胞，表達24 h。細胞消化后加至多聚-L-賴氨酸包被的玻璃蓋玻片上，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 左右，進行膜片鉗實驗。

膜片鉗實驗參見我們先前方法[14]。電極內(nèi)液為 140 mmol/L CsCl、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES 及 1 mmol/L EGTA，用 CsOH 調(diào)節(jié) pH 值為7.3；細胞外液為135 mmol/L N-甲基-D-葡萄糖胺、20 mmol/L BaCl2·2H2O、2 mmol/L MgCl2·2H2O 及 10 mmol/L HEPES，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 值為7.2。采用數(shù)模轉(zhuǎn)換器（DigiData 1440A）記錄原始電流值變化，用Multiclamp 700B 放大器將電流放大，在室溫下（23～25℃）進行全細胞膜片鉗記錄。各試驗參數(shù)如下：鉗制電壓-80 mV，激發(fā)電壓+10 mV，持續(xù) 200 ms，10 s 每周期，電流信號經(jīng) 2 kHz 低通濾波器處理，采樣率為5 kHz。

原始數(shù)據(jù)用Clampex 10.3 處理，獲得對照組和給藥組的峰電流I，計算出響應(yīng)率（I/I0）和抑制率（1-響應(yīng)率）。用如下GraphPrism（GraphPad Software）的Hill 方程擬合劑量-抑制活性曲線獲得IC50：

其中，I0表示峰電流的最大值，［CToxin］代表抑制劑的濃度，IC50為半抑制濃度，nH 代表 Hill 系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 多肽的合成與純化

Bu1 及Bu13 線性肽、折疊溶液和純化后產(chǎn)物的HPLC 見圖1。結(jié)果表明，Bu1 線性肽折疊產(chǎn)生1 個主峰，Bu13 線性肽折疊獲得2 個主峰。由于ω-芋螺毒素的二硫鍵連接方式為C1-C4、C2-C5、C3-C6，為緊湊型球狀結(jié)構(gòu)，一般在HPLC 分析中出峰較早，因此出峰早者為目標(biāo)肽。Bu1 及Bu13 純品肽純度均大于95%，經(jīng)質(zhì)譜測定，與理論計算值一致。

2.2 圓二色譜

Bu1 及Bu13的CD譜見圖2。理論上多肽的α螺旋結(jié)構(gòu)在 222、208 nm 處呈負(fù)峰，190 nm 附近為正峰；β折疊在 217～218 nm 處顯負(fù)峰，195～198 nm 顯正峰；無規(guī)卷曲的CD 譜在198 nm 附近有一負(fù)峰。結(jié)果表明，Bu1 及Bu13 在220 nm 附近有一小而寬的正峰，說明該二肽均含有β折疊，但含量較MⅦA的β折疊稍低。

2.3 Bu1及Bu13對N型鈣離子通道的抑制活性

對N 型鈣離子通道的抑制活性見圖3及表1。結(jié)果表明，Bu1 及 Bu13 一峰的 IC50分別為 0.87及1.03 μmol/L，較MⅦA（0.21 μmol/L）活性低，Bu13 二峰無活性。

圖1 Bu1和Bu13線性肽、折疊液及純肽的HPLC分析

圖2 Bu1、Bu13的圓二色譜圖

2.4 Bu1及Bu13對P/Q及L型鈣通道的抑制活性

10 μmol/L Bu1 及 Bu13 對 P/Q 及 L 型鈣離子通道的抑制活性見表1。10 μmol/L Bu1 及Bu13對P/Q 型鈣離子通道的抑制率分別為17.05%及13.1%，略高于MⅦA（8.92%）；10 μmol/L Bu1 對L型鈣離子通道的抑制率為19.31%，Bu13 與MⅦA對L 型鈣離子通道的抑制活性低（＜5%）。

3 討論

MⅦA的構(gòu)效關(guān)系研究表明，Lys2、Arg10、Leu11、Tyr13、Arg21、Arg24及 N 端的氨基是功能氨基酸[16-17]。Bu1、Bu13 與MⅦA的氨基酸差別主要為loop1的第 4、loop2的第 9、loop3的第 17、18 位殘基。MⅦA loop1的第4 位殘基雖然不是關(guān)鍵氨基酸，但引入Pro 可能改變了分子構(gòu)象（圖2），影響B(tài)u1及Bu13的抑制活性。Bu1和Bu13的loop2第9位殘基是疏水氨基酸，而MⅦA的第9位殘基為Ser，其他作用于N 型鈣通道的ω-芋螺毒素在該位置也為Ser 或堿性氨基酸，如SO-3、CⅥD、MⅦC等[18-20]，因此我們推測Bu1和Bu13的loop2第9位疏水氨基酸殘基可能影響活性。此外，Bu1 及Bu13的 loop3 第 17、18 位殘基為體積較大的 Tyr 及Lys，與其他ω-芋螺毒素此處為 Thr（Ser）及Gly顯著不同，也可能影響其活性。

M ⅦC的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究表明，Arg9、Lys10、Arg22、Arg23是結(jié)合 P/Q 型鈣離子通道的重要氨基酸[20]。相對 Bu13 而言，Bu1的第Ⅳ個 loop的堿性氨基酸Arg的排列不同，其與MⅦC 類似，但Bu13 與MⅦA的loop4 堿性氨基酸排列類似，因此推測Bu1 有稍高的P/Q 鈣離子通道結(jié)合活性可能與其第Ⅳ個loop的堿性氨基酸殘基有關(guān)。

另外，Bu1 對L 型鈣離子通道的抑制活性高于MⅦA，但Bu13 及MⅦA 對L 型鈣離子通道的活性很低。但有關(guān)ω-芋螺毒素對L 型鈣離子通道的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究很少，Bu1 有一定的L 型鈣離子通道抑制活性的原因尚不清楚。

總之，我們合成了2 種新型ω-芋螺毒素，并對其作用靶點進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)Bu1、Bu13 選擇性作用于N 型鈣離子通道，對P/Q、L 型鈣離子通道的抑制作用較低。該工作為研究ω-芋螺毒素構(gòu)效關(guān)系及設(shè)計新型N 型鈣離子通道抑制劑提供了依據(jù)。

表1 ω-芋螺毒素Bu1及Bu13對鈣離子通道的抑制活性

圖3 Bu1及Bu13對N型鈣離子通道的抑制活性