王賽賽，李同牛，何 磊，單淑芳，李志強(qiáng)，徐欽祥

（安徽口子酒業(yè)股份有限公司，安徽淮北235000）

口子窖酒是安徽傳統(tǒng)名酒，歷經(jīng)幾代釀酒人傳承發(fā)展，造就了其獨(dú)特兼香風(fēng)格特征，逐步走進(jìn)國家名酒行列。生產(chǎn)中堆積工藝被稱為二次制曲，是大曲酒中特殊操作方式，是富集有益微生物定向培養(yǎng)的核心技術(shù)，是在酶類和微生物共同作用下產(chǎn)生合成多種香味物質(zhì)或其前驅(qū)物質(zhì)的重要過程[1-3]。

黃淮地區(qū)，入冬到來年初春，氣候干燥，少雨陰冷，氣候條件不能完全滿足堆積工藝要求。根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂驙顩r，堆積廠房設(shè)計(jì)帶有溫度控制系統(tǒng)的專用溫室，并配備濕度儀，通過對溫室內(nèi)溫度與濕度的調(diào)節(jié)，使糟醅安全度過寒冷季節(jié)，減少堆積不升溫現(xiàn)象。

本研究對口子酒業(yè)某班組2018年3月份生產(chǎn)期間A、B、C共3個(gè)窖池進(jìn)行跟蹤，對堆積糟醅溫度、微生物種類數(shù)量進(jìn)行檢測，對入池發(fā)酵蒸餾后出酒率進(jìn)行對比分析，找出堆積溫度和微生物變化規(guī)律，以及與相應(yīng)出酒率的關(guān)系。

跟蹤堆積期間，外界天氣穩(wěn)定，多為多云轉(zhuǎn)晴，風(fēng)向不定，風(fēng)級1～2級，溫度在5～20℃之間。溫室溫度控制在22℃左右，濕度通過地面灑水控制，保持在80%～90%之間，堆積時(shí)間為3 d，入窖發(fā)酵期在35 d左右。

1 材料與方法

1.1 材料

口子酒業(yè)某班組3月份堆積與窖內(nèi)發(fā)酵糟醅，取樣點(diǎn)和測溫點(diǎn)保持一致。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑藥品均為分析純。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

儀器設(shè)備：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、立式恒溫生化培養(yǎng)箱、搖床、培養(yǎng)皿、玻璃量筒、玻璃燒杯、試管、三角瓶、酒精燈、涂布棒等。

1.2.3 分離培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g，水1 L，pH7.0、121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、1/3000孟加拉紅溶液100 mL、氯霉素 0.1 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溫度跟蹤測定

堆積過程溫度測定：選擇兩個(gè)測溫點(diǎn)，一個(gè)在堆芯位置（距地面高50 cm左右，中心位置），另一個(gè)在堆邊位置（在糟醅堆高三分之二處，距表層20 cm左右）。整條窖池酒醅蒸餾攤晾加曲堆積結(jié)束后測溫取樣，測溫點(diǎn)和取樣點(diǎn)位置相同，記錄堆積時(shí)間為0 d。然后每隔1 d測溫取樣，依次類推，直至入窖。

糟醅堆積升溫達(dá)到入窖條件后，將糟醅混勻入窖，糟醅溫度測定采用酒靈通測溫桿測量，選擇3個(gè)測溫點(diǎn)：上層（距窖池表面30 cm）、中層（距窖池表面80 cm），下層（距窖池表面120 cm）。糟醅入窖后測量溫度取樣，測溫點(diǎn)和取樣點(diǎn)位置相同，記錄窖內(nèi)時(shí)間為0 d。溫度每天測量，糟醅每隔5 d取樣，依次類推，直至蒸餾。

1.3.2 菌株種類分離和數(shù)量鑒定

微生物分離培養(yǎng)及計(jì)數(shù)采用稀釋平板菌落分離計(jì)數(shù)法：準(zhǔn)確稱取10 g糟醅，加入到含有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，加入適量無菌玻璃珠，放入搖床（150 r/min）室溫下振蕩打散30 min，取出靜置。取1 mL上清液加入9 mL無菌生理鹽水中，配制成10-2菌懸液，依次類推，配制成10-3、10-4、……、10-7菌懸液，將菌懸液均勻涂布于平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。酵母和霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)24 h后記錄酵母菌菌落數(shù)量，48 h后記錄霉菌菌落數(shù)量；細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)24 h后記錄細(xì)菌菌落數(shù)量[4-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅堆積過程溫度及微生物數(shù)量變化

由于溫度控制系統(tǒng)應(yīng)用，堆積廠房溫度可以控制恒溫，保持在22℃左右。生產(chǎn)上堆積起始溫度需根據(jù)季節(jié)氣溫變化予以相應(yīng)變化，在3月份生產(chǎn)，起始溫度控制在26～32℃，堆積時(shí)間為3 d。堆積發(fā)酵成熟以糟堆四周升溫是否均勻且達(dá)到50℃左右為依據(jù)。隨糟醅堆積時(shí)間的延長，前期升溫緩慢，后期升溫快，堆芯位置升幅小，堆邊位置升幅大。從微生物角度分析，不同位置微生物生長情況有差異，堆芯酵母菌、細(xì)菌緩慢增殖后微降，霉菌數(shù)量則是快速減少到檢測不到，堆邊糟醅細(xì)菌和酵母菌數(shù)量先緩慢增加，接著快速增加，然后迅速減少，霉菌則是先緩慢增加，后迅速增加。

2.1.1 堆芯溫度及微生物數(shù)量的變化(圖1)

圖1為糟醅堆積過程中堆芯溫度及微生物數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。圖1（a）顯示，糟醅堆芯的初始溫度在30～32℃之間，和同堆堆邊相比，溫度略高；在0～1 d間溫度呈現(xiàn)較平穩(wěn)或略有下降的趨勢；1 d以后溫度緩慢上升，升溫幅度在4～6℃之間，糟醅最終溫度保持在30～35℃。由圖1（b）可以看出，堆芯酵母菌數(shù)量前期增長較為平緩，數(shù)量增加不多，在堆積第3天有減少現(xiàn)象。圖1（c）中，細(xì)菌數(shù)量前期增長較為平緩，后期微有降低。圖1（d）中，堆芯霉菌數(shù)量前期迅速下降，后期幾乎檢測不到，這是因?yàn)槎研狙鯕獠粩嘞?，?dǎo)致霉菌等好氣性微生物大量死亡。

2.1.2 堆邊溫度及微生物數(shù)量變化(圖2)

圖1 堆芯糟醅溫度及微生物數(shù)量變化

圖2 堆邊糟醅溫度及微生物數(shù)量變化

圖2為糟醅堆積過程中堆邊溫度及微生物數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。從圖2（a）可以看出，糟醅堆邊初始溫度在26～28℃，前期0～1 d升溫緩慢，2 d以后升溫較快，3～4 d堆積發(fā)酵成熟時(shí)溫度可達(dá)50℃左右，升溫幅度在20℃左右。圖2（b）、圖2（c）顯示，堆邊糟醅中酵母菌、細(xì)菌數(shù)量增長情況相似，開始時(shí)數(shù)量較少，在1 d后快速增長，在2 d時(shí)總數(shù)達(dá)到最大值，隨后在第3天時(shí)酵母菌、細(xì)菌總數(shù)又迅速減少；與圖2（a）相比，可以看出，當(dāng)堆積溫度適宜于酵母菌、細(xì)菌生長時(shí)，酵母菌、細(xì)菌快速繁殖，當(dāng)超過細(xì)菌和酵母適應(yīng)溫度，酵母菌、細(xì)菌開始大量死亡。圖2（d）表明，霉菌數(shù)量隨時(shí)間延長，糟醅溫度的上升一直在加快增長，這是由于氧氣充足、營養(yǎng)豐富、溫度適宜利于耐高溫性霉菌快速繁值。

2.2 入窖后酒醅溫度和微生物數(shù)量變化（圖3）

圖3 入窖后糟醅發(fā)酵溫度及微生物數(shù)量變化曲線

圖3為糟醅入窖后溫度及微生物數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。酒醅入窖溫度變化曲線見圖3（a）、圖3（b）、圖3（c），上層位置溫度開始階段迅速下降，4～6 d后溫度呈現(xiàn)類似波浪式變化；中層位置溫度先升高2～3℃，接著緩慢下降；下層溫度先迅速下降然后緩慢下降。這與各層糟醅中微生物發(fā)酵產(chǎn)熱和自然散熱有關(guān)，上層與外界熱量互換頻繁，致使溫度變化較大；中層與外界相距較遠(yuǎn)，易聚溫，出現(xiàn)先升后降的狀況；下層與土地接觸，熱量被大地吸收，導(dǎo)致溫度處于下降趨勢。

酒醅入窖微生物數(shù)量變化曲線見圖3（d）—圖3（i），細(xì)菌、酵母、霉菌數(shù)量呈下降趨勢，酵母菌數(shù)量在前5 d迅速減少，5～15 d緩慢下降，15～20 d酵母菌還有一個(gè)迅速下降階段，20 d后緩慢減少。這是由于糟醅入窖后，酵母菌需要適應(yīng)新的環(huán)境，大量酵母菌因不適應(yīng)環(huán)境而死亡，適應(yīng)的酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生酒精，酒精濃度增大又會抑制酵母菌生長，導(dǎo)致大部分酵母菌死亡，殘留的酵母菌則處于鈍化休眠狀態(tài)。細(xì)菌數(shù)量在前5 d迅速減少，然后微有增加過后緩慢減少，可能是窖內(nèi)氧氣的迅速消耗，好氧菌大量死亡，厭氧或者兼性厭氧細(xì)菌繁殖，隨著酒精含量增高抑制細(xì)菌生長，致使細(xì)菌數(shù)量緩慢減少。霉菌數(shù)量前5 d迅速下降，接著緩慢下降，15 d后幾乎檢測不到，應(yīng)該是由于氧氣大量消耗導(dǎo)致好氧菌大量死亡。

2.3 入窖酒醅酵母菌密度與發(fā)酵蒸餾后出酒率

各窖池入池糟醅酵母菌密度與發(fā)酵蒸餾后出酒率見表1。

表1 各窖池入池糟醅酵母菌密度與出酒率

由表1可以看出，最終產(chǎn)量與入池后糟醅中的酵母菌密度有正相關(guān)趨勢，而糟醅中酵母菌含量又與堆積工藝有直接關(guān)系。糟醅理化指標(biāo)、酵母菌接種量及糟醅收堆溫度均有可能影響堆積糟醅酵母菌含量。因此，堆積工藝是口子窖酒的核心，是保證出酒率的關(guān)鍵。

3 結(jié)論

本文對口子窖酒生產(chǎn)中堆積工藝和入窖糟醅溫度、微生物及出酒率進(jìn)行了研究，可以得出如下結(jié)論：

（1）糟醅堆積隨時(shí)間延長，前期升溫緩慢，后期升溫快，堆芯升幅小，堆邊升幅大。堆芯糟醅酵母菌、細(xì)菌生長平緩，升幅不大，霉菌則逐漸死亡。堆邊糟醅酵母菌、細(xì)菌開始生長緩慢，1 d后快速增長，2 d時(shí)總量達(dá)到最大值，后又慢慢減少，霉菌則是一直增長。

（2）入窖后，上層糟醅溫度迅速下降，4～6 d后溫度呈現(xiàn)波浪變化；中層溫度先升高2～3℃，后緩慢下降；下層溫度先迅速下降后變緩。糟醅中微生物數(shù)量先是在0～5 d迅速下降，5～15 d酵母菌、細(xì)菌數(shù)量緩慢減少，15～20 d較為迅速減少，20 d后變緩，而霉菌則是5～20 d緩慢減少直到無法檢出。

（3）窖池酒醅蒸餾后出酒率與入窖后糟醅中酵母菌數(shù)量有正相關(guān)趨勢。

通過研究了解口子窖酒生產(chǎn)堆積及窖內(nèi)發(fā)酵中微生物和溫度的變化趨勢，研究結(jié)果對生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。