王 喆，曹倩雯，韓 嬌，孫細(xì)珍，劉源才

（1.勁牌有限公司，湖北黃石435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北黃石435100）

中國白酒中物質(zhì)十分豐富，其中主體成分酒精與水的含量占總量的97%～98%，風(fēng)味微量成分占2%～3%[1]，但是其種類眾多，決定了酒體的香型差異。根據(jù)化學(xué)性質(zhì)不同，可以將酒中的風(fēng)味物質(zhì)分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類化合物、硫化物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物以及其他化合物。白酒中的各種風(fēng)味物質(zhì)含量從每升中幾納克到幾百毫克不等，對其準(zhǔn)確定量非常困難?，F(xiàn)有的分析方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜[2-3，11-12]、多維氣相色譜-質(zhì)譜[4-5]、氣相色譜-聞香[6-8]、二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜[9-10]，以上分析方法主要基于氣相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的分析方法，分析的對象以揮發(fā)、半揮發(fā)類物質(zhì)為主。白酒中還有一部分不揮發(fā)的物質(zhì)，其中大部分不揮發(fā)物質(zhì)以酸類物質(zhì)為主，是白酒中重要風(fēng)味物質(zhì)，構(gòu)成白酒風(fēng)味的骨架成分[13-14]，基于氣相色譜的分析方法無法進(jìn)行檢測。小曲白酒作為中國保健酒第一品牌的中國勁酒的主要原料，為了不斷提升中國勁酒口感與品質(zhì)，對其揮發(fā)性成分做了較為系統(tǒng)的研究，對其不揮發(fā)風(fēng)味成分的研究才剛剛開始。

新工藝原酒其生產(chǎn)過程是采用機(jī)械化生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)用酒曲使用的是純種培養(yǎng)，然后按比例混合的混合曲，其保持了傳統(tǒng)工藝原酒風(fēng)格，同時口感更加純凈。為了明確兩種原酒口感差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，本工作采用超高效液相色譜和基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜技術(shù)[17，19，24]的臺式質(zhì)譜儀，結(jié)合組學(xué)分析[15-16，18]軟件 Compound Discoverer2.0，對不同工藝生產(chǎn)的小曲白酒中的不揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，聚焦于其中的標(biāo)志性差異化合物，期望為小曲白酒釀造工藝升級、釀造微生物選擇，提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：勁牌有限公司生產(chǎn)。A酒樣為新工藝混合曲生產(chǎn)原酒，生產(chǎn)線上抽取10個批次；B酒樣為傳統(tǒng)工藝傳統(tǒng)曲生產(chǎn)原酒，生產(chǎn)線上抽取10個批次。

試劑：甲酸銨、甲醇、甲酸，以上試劑均為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、高純氮氣（99.999%，武鋼生產(chǎn)）。

儀器設(shè)備：Ultimate 3000 RSLC超高效液相色譜儀聯(lián)用Q Exactive MS臺式高分辨質(zhì)譜儀（配有Compound Discoverer 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），美國賽默飛世爾公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品溶液制備

取0.5 mL酒樣過0.22 μm有機(jī)膜，作為供試品溶液待用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Accucore C18(100×2.1 mm，2.6μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動相：水相（W）5 mM甲酸銨以及0.1%甲酸水溶液，有機(jī)相（M）5 mM甲酸銨以及0.1%甲酸甲醇溶液；A相流動相組成為98∶2（W∶M），B相流動相組成為2∶98（W∶M），A相濃度洗脫梯度：0～1 min，100%；1～6 min，1000%～50%；6～15 min，50%～0%。1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源（HESI，正負(fù)切換）；噴霧電壓：3000 V(+)，2500(-)；離子源溫度：300 ℃；鞘氣氣壓：35 arb；輔助氣壓：10 arb；毛細(xì)管溫度：350℃。質(zhì)譜掃描模式：Full MS-ddMS2(TOP 3)；掃描范圍：100～900 m/z；分辨率：70000(FWHM)at m/z 200，F(xiàn)ull MS-17500(FWHM)at m/z 200，MS/MS；掃描間隔：2.0 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Compound Discoverer 2.0（簡稱 CD2.0）對組分進(jìn)行提取、過濾及統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件考察

為保證白酒樣品中盡可能多的成分能夠有效地被測定，對色譜分析條件進(jìn)行了摸索，從圖1可以看出，絕大多數(shù)化合物出峰時間在5 min之后，且各組分分布均勻，表明色譜條件選擇合適。從圖2可以看出，橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為分子量，結(jié)果顯示在所采用的色譜條件下，化合物的出峰時間合適，其分布較為均勻。

圖1 兩種工藝酒樣的輪廓圖

2.2 數(shù)據(jù)重現(xiàn)性考察

在代謝組學(xué)[20-22，25]相關(guān)試驗中，方法的重現(xiàn)性至關(guān)重要，需要保證數(shù)據(jù)在質(zhì)量精度、保留時間及響應(yīng)強度等方面具有很好的重現(xiàn)性。本實驗在進(jìn)樣序列中穿插了質(zhì)控樣品，對系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行了考查。質(zhì)控樣品的相關(guān)檢測數(shù)據(jù)見表1。

圖2 不同化合物保留時間分布圖

表1 質(zhì)控樣檢測數(shù)據(jù)

從表1可以看出，實際檢測過程中，保留時間偏差≤0.05 min，峰面積的RSD為2.1%，質(zhì)量精度的偏差≤1.5 mg/L，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性符合要求。

圖3為化合物（m/z149.09609）提取后的色譜圖，利用其保留時間和峰面積，考查色譜的穩(wěn)定性；圖4為化合物（m/z149.09609）質(zhì)譜圖，利用其m/z考察質(zhì)譜的穩(wěn)定性。

圖3 化合物（m/z149.09609）XIC圖

從圖3、圖4可以看出，在整個進(jìn)樣周期內(nèi)，以某一化合物（m/z149.09609）理論值考查的保留時間(RT)偏差＜0.05 min，峰面積的RSD為2%左右，質(zhì)量精度的偏差在1.5 mg/L以內(nèi)，表明系統(tǒng)有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和質(zhì)量精度。

圖4 化合物質(zhì)譜圖

2.3 不同原酒風(fēng)味物質(zhì)差異統(tǒng)計學(xué)分析

采用CD 2.0軟件對組分峰進(jìn)行提取和過濾，確定以P-Value＜0.05，F(xiàn)old Change=2對峰進(jìn)行過濾。Fold Change=2排除差異較小的化合物，PValue統(tǒng)計學(xué)中的假設(shè)檢驗，p值是將觀察結(jié)果認(rèn)為有效即具有總體代表性的犯錯概率。

圖5 兩種原酒的火山圖

圖5為兩種工藝原酒組分分析的火山圖，從圖5可以看出，A組內(nèi)的組分差異要比B組內(nèi)組分差異要小。是由于傳統(tǒng)工藝所用酒曲為自然接種的傳統(tǒng)曲，其中混入了雜菌，導(dǎo)致酒體中的雜味物質(zhì)較多。新工藝原酒生產(chǎn)采用的機(jī)械化生產(chǎn)工藝和純種培養(yǎng)的混合曲，生產(chǎn)過程控制較好，故酒體雜質(zhì)少，且酒的品質(zhì)均一和穩(wěn)定性要好。

表2 差異化合物鑒定表

主成分分析（PCA分析），是一種分析、簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時保持?jǐn)?shù)據(jù)集中的對方差貢獻(xiàn)最大的特征。這是通過保留低階主成分，忽略高階主成分做到的。這樣低階成分往往能夠保留住數(shù)據(jù)的最重要方面。

通過對有顯著性差異的化合物做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低緯度空間反映樣品之間的關(guān)系。

圖6 兩種原酒PCA分析圖

圖6是兩種原酒的組分PCA分析圖，從圖6可以看出，兩種樣品可以清晰的按照生產(chǎn)工藝區(qū)分為兩組，說明不同生產(chǎn)工藝所生產(chǎn)的樣品所含成分有一定差異，且B組樣品組內(nèi)差異比A組大。

2.4 差異化合物鑒定

找出兩組樣品中有差異的化合物，可以明確兩種原酒口感差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，為工藝以及酒曲配方升級提供依據(jù)。根據(jù)標(biāo)記物的精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布和二級碎片離子等信息，采用CD2.0軟件和ChemSpider[19-20]、mzCloud 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫[24]對有差異的化合物進(jìn)行了鑒定和確證。鑒定結(jié)果見表2。

圖7是兩種不同工藝原酒中標(biāo)志性差異化合物的峰面積箱型圖，以峰面積差在兩倍以上為篩選條件，篩選出了7種標(biāo)志性差異成分。

從圖7a至圖7f可以看出，苯乙酮、戊二酸、茴香腦、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮為B組內(nèi)的標(biāo)志性成分，顯著高于A組。從圖7g可以看出，4-異丁基苯甲酸為A組內(nèi)標(biāo)志性成分，顯著高于B組。

3 結(jié)論

對小曲白酒的質(zhì)量鑒別現(xiàn)主要采用對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析、鑒別。為了評價小曲白酒中不揮發(fā)性物質(zhì)對小曲白酒品質(zhì)的影響，采用超高效液相色譜和Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀，對不同工藝小曲白酒中不揮發(fā)性成分作了分析。通過組學(xué)分析軟件從眾多不揮發(fā)性成分中篩選出差異明顯的物質(zhì)，明確了新工藝混合曲與傳統(tǒng)工藝曲生產(chǎn)的原酒之間差異的不揮發(fā)性物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)其精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級碎片離子信息，采用CD2.0軟件和chemspider進(jìn)行了鑒定，其為苯乙酮、戊二酸、茴香腦、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮、4-異丁基苯甲酸7種化合物。

通過不揮發(fā)性物質(zhì)的分析和采用組學(xué)分析的手段，對不同工藝的小曲白酒的鑒別，能夠明顯區(qū)分兩種工藝小曲白酒，為小曲白酒的品質(zhì)鑒別、生產(chǎn)一線原酒分級提供了一種解決思路，能有效緩解生產(chǎn)一線原酒品評員不足的問題。

注：a.標(biāo)記物1在兩組中峰面積箱型圖；b.標(biāo)記物2在兩組中峰面積箱型圖；c.標(biāo)記物3在兩組中峰面積箱型圖；d.標(biāo)記物4在兩組中峰面積箱型圖；e.標(biāo)記物5在兩組中峰面積箱型圖；f.標(biāo)記物6在兩組中峰面積箱型圖；g.標(biāo)記物7在兩組中峰面積箱型圖。