胡麗香，王麗金，宋煥祿，陳岳林，金永春 ，張秉海

（1.北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048；2.瑞金客佳紅釀造股份有限公司，江西瑞金342500）

臍橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)，又名甜橙、香橙、橙子，屬雙子綱，蕓香科，常年蔥綠隸屬小喬木，是世界各國(guó)競(jìng)相栽種的優(yōu)良柑橘品種。臍橙富含人體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是優(yōu)良的綠色營(yíng)養(yǎng)豐富的保健食品[1]。據(jù)中醫(yī)記載，臍橙具有疏理通氣、生津止渴、健胃消食的功效，經(jīng)常食用可減肥健體、清火養(yǎng)顏、降低膽固醇、盡可能地抑制有色金屬和放射性元素在人體內(nèi)積累，對(duì)防癌抗癌也有一定作用[2]。在我國(guó)，部分地區(qū)擁有成熟的優(yōu)良臍橙品種栽培技術(shù)，如江西的贛州，其臍橙的規(guī)模已然躍居世界第三和全國(guó)第一的位置[3]。面對(duì)著逐年攀升的產(chǎn)量，臍橙作為水果鮮食這種產(chǎn)品結(jié)構(gòu)已無(wú)法與其巨大的產(chǎn)量相匹配，容易出現(xiàn)果實(shí)滯銷、保鮮期短的困難[4]。目前，臍橙精深加工業(yè)發(fā)展滯后，低端產(chǎn)品過(guò)多，高端產(chǎn)品較少。因此，提高臍橙精深加工水平，開發(fā)臍橙深加工產(chǎn)品，加大臍橙深加工量刻不容緩[5]。而臍橙中存在的高級(jí)醇、醛、酮、酯等揮發(fā)性香氣成分對(duì)臍橙深加工產(chǎn)品的質(zhì)量影響巨大。因此，對(duì)臍橙深加工產(chǎn)品中揮發(fā)性香氣成分的分析、了解與控制環(huán)節(jié)至關(guān)重要。

隨著社會(huì)的發(fā)展與進(jìn)步，人們對(duì)酒的需求逐漸多樣化，不僅需要高度的蒸餾酒，低度的釀造酒也越來(lái)越受歡迎，同時(shí)對(duì)酒品質(zhì)的要求也不斷提高[6]。而臍橙果酒是以臍橙鮮果或果汁為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵后過(guò)濾得到的澄清的低醇飲料[7]。在保留臍橙中各種無(wú)機(jī)鹽、維生素、蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分和果香的同時(shí)，引入了酵母發(fā)酵產(chǎn)生的特殊發(fā)酵風(fēng)味，口感溫和爽滑[8]。臍橙蒸餾白酒是在發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步蒸餾得到的高度酒，具有蒸餾白酒酒香的同時(shí)，保留有部分臍橙的特色風(fēng)味。因此，臍橙果酒和臍橙白酒作為具有特色的臍橙深加工產(chǎn)品，存在著較大的市場(chǎng)潛力。

目前，已有一些對(duì)臍橙深加工產(chǎn)品如臍橙果汁和臍橙果酒香氣成分研究的報(bào)道?，F(xiàn)有的研究多是基于氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，如李曉英等[9]利用溶劑萃取法結(jié)合GC-MS對(duì)臍橙果汁和果酒的香氣成分的分析，劉琨毅等[10]利用GC-MS研究了不同柑橘品種對(duì)柑橘果酒香氣成分的影響，郭莉等[11]對(duì)于貯藏過(guò)程中夏橙汁香氣成分的變化進(jìn)行了分析。然而，并不是所有的可揮發(fā)性成分對(duì)臍橙果酒和臍橙白酒的香氣都有貢獻(xiàn)[12]。其中不乏一些含量高，但其閾值也較高的揮發(fā)性成分，對(duì)臍橙果酒和臍橙白酒的香氣表現(xiàn)影響并不大。同時(shí)，也存在一部分含量極低、但閾值也極低的香氣成分，其香氣貢獻(xiàn)頗大，是臍橙果酒和臍橙白酒的香氣組成中不可缺少的部分。本研究是基于氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-olfactometry-MS，GC-O-MS），即在GCMS的基礎(chǔ)上，結(jié)合嗅聞對(duì)臍橙果酒和白酒的香氣成分進(jìn)行分析。GC-O-MS分析儀器利用人機(jī)結(jié)合的方式，通過(guò)鼻子的嗅聞，直接對(duì)經(jīng)GC分離后的單體香料的呈味特性進(jìn)行分析，是迄今為止氣味化合物鑒定最為經(jīng)典的一種方式[13]。此外，為了更準(zhǔn)確地研究臍橙果酒和臍橙白酒中關(guān)鍵的香氣成分，本研究利用香氣成分稀釋分析（Aroma extract dilution analysis，AEDA）法，即將香氣提取物進(jìn)行連續(xù)稀釋，再分別利用GC-O-MS進(jìn)行分析，直到完全無(wú)法嗅聞到氣味為止。由此，本研究以探索臍橙果酒和臍橙白酒中的真正具有香氣活性的成分為目的，為從風(fēng)味上改進(jìn)臍橙果酒和白酒釀造工藝，提高其產(chǎn)品品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：臍橙果酒（12%vol）和臍橙白酒(53%vol)，江西瑞金客佳紅釀造股份有限公司提供。

內(nèi)標(biāo)：2-甲基-3-庚酮，由SIGMA-ALDRICH公司提供。

正構(gòu)烷烴系列標(biāo)品：C7—C30，由北京普惠沃野能源技術(shù)有限公司提供。

儀器設(shè)備：固相微萃取裝置（SPME手柄、50/30 μmDVB/CAR/PDMS 萃取頭），美國(guó) Supelco公司；Agilent 7890A/7000C GC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；Sniffer 9000嗅聞檢測(cè)儀，瑞士Brechbuhler公司；HH-1恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固相微萃取

1.2.1.1 臍橙白酒樣品的處理

將臍橙白酒用超純水稀釋5倍后，取6 mL于40 mL的頂空瓶?jī)?nèi)，加入1.0 g NaCl和1 μL內(nèi)標(biāo)，蓋上頂空瓶蓋，在60℃的恒溫水浴鍋內(nèi)平衡20 min，然后將50/30 μm的DVB/CAR/PDMS香氣成分萃取頭插入頂空瓶?jī)?nèi)，吸附40 min后拔出萃取頭，迅速插入GC進(jìn)樣口解吸5 min，接著進(jìn)行GC-O-MS分析。

1.2.1.2 臍橙果酒樣品的處理

取臍橙果酒6 mL于40 mL的頂空瓶?jī)?nèi)，加入1.0 g NaCl和1 μL內(nèi)標(biāo)，重復(fù)1.2.1.1中的平衡，吸附、解吸等操作。

1.2.2 GC分析

色譜柱：極性Agilent DB-Wax(50 m ×250 μm×0.25 μm)的彈性石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：10∶1；載氣：高純度的氦氣（99.9999%）；流速：1 mL/min；升溫程序：起始溫度50℃，保持3 min，運(yùn)行3 min，以4.8℃/min升溫到200℃，運(yùn)行36.33 min，然后以10.0℃/min升溫到250℃，保持3 min，共運(yùn)行42.33 min。

1.2.3 MS分析

離子源：EI源；離子源溫度為230℃；接口溫度：280℃；電子轟擊的能量為70 eV；溶劑延遲4 min；質(zhì)量掃描范圍：全掃描。

1.2.4 GC-O分析

選取經(jīng)過(guò)專業(yè)聞香培訓(xùn)的品評(píng)人員對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的樣品進(jìn)行GC-O分析和香氣提取物稀釋分析。

1.2.5 香氣提取物稀釋分析（AEDA）

對(duì)臍橙果酒和臍橙白酒的香氣提取物分別按照1∶21、1∶22、1∶23、1∶24……進(jìn)行稀釋[14]，每一次稀釋后的樣品都利用GC-O進(jìn)行嗅聞分析，直到嗅聞不到為止，停止稀釋。初始樣品中香味化合物的濃度與最大稀釋后的樣品中該化合物的濃度的比值，即稀釋倍數(shù)，被稱為稀釋因子（Flavor dilution factor，F(xiàn)D值）。FD因子越大，表明該氣味越關(guān)鍵。

表1 臍橙果酒與臍橙白酒香氣成分表

1.2.6 化合物的鑒定方法

定性分析：采取NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索、保留指數(shù)比對(duì)和嗅聞3種方法進(jìn)行定性。

定量分析：本實(shí)驗(yàn)選取2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)，配制內(nèi)標(biāo)溶液，其濃度作為已知量，通過(guò)Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00軟件讀出的峰面積，結(jié)合特定公式C1/C2=A1/A2（C：表示濃度，單位μg/L；A：表示化合物峰面積），即可對(duì)相應(yīng)香氣化合物進(jìn)行定量。

1.2.7 保留指數(shù)的測(cè)定

取1.0 μL正構(gòu)烷烴系列標(biāo)品混樣，采用直接進(jìn)樣的方式，通過(guò)GC-MS進(jìn)行分析，獲得各個(gè)烷烴相應(yīng)的保留指數(shù)，結(jié)合公式即可計(jì)算出每種香氣化合物的保留指數(shù)（Retention index,RI）[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙果酒的香氣成分結(jié)果分析（表1）

由表1可知，臍橙果酒中檢測(cè)出11種醇類，9種酯類，3種醛類，2種酸類，共25種香氣成分。醇類物質(zhì)占香氣成分的比例最大，為72.65%，酯類物質(zhì)占香氣成分的18.44%，醛類物質(zhì)占比為5.36%，酸類物質(zhì)占比最少為3.55%。通過(guò)對(duì)臍橙果酒進(jìn)行香氣成分稀釋分析，可知臍橙果酒的關(guān)鍵香氣成分共10種，且主要是醇類和酯類物質(zhì)（表1，圖1）。其中稀釋因子在8及8以上的包括具有蘋果味的丁酸乙酯和甲基丁酸乙酯、具有果香味的辛酸乙酯等3種酯類，以及具有酒精味的丙醇、堅(jiān)果味的己硫醇、花香味的芳樟醇和具有玫瑰花味道的2-苯乙醇，共4種醇類。臍橙果酒中香氣呈味最濃烈的為具有堅(jiān)果味的己硫醇，其稀釋因子達(dá)到了2048，其對(duì)臍橙果酒的香氣貢獻(xiàn)最大。已有研究報(bào)道表明，己硫醇是醬香型白酒中的主要含硫香氣成分之一[17]，在臍橙果酒中己硫醇是首次檢出。雖然己硫醇呈香作用顯著，但其含量卻極低，僅為2.56 μg/L±0.91 μg/L，遠(yuǎn)小于含量為579.70 μg/L±190.12 μg/L的戊醇（稀釋因子為2），同時(shí)，辛醇含量卻高達(dá)763.21 μg/L±176.88 μg/L，然而在稀釋到21倍后聞不到該化合物的特征性氣味。由此可知，一種香氣成分的呈香關(guān)鍵性與其含量高低無(wú)關(guān)。在所有酯類成分中，具有菠蘿味的乙酸乙酯的含量最高為212.13 μg/L±67.55 μg/L，其次是具有果香味的琥珀酸二乙酯含量為103.24 μg/L±36.94 μg/L，然而，這兩者同上述辛醇一樣，在稀釋到21倍后已聞不到該化合物的特征性氣味。

2.2 臍橙白酒的香氣成分結(jié)果分析

圖1 臍橙果酒香氣提取物稀釋分析圖

圖2 臍橙白酒香氣提取物稀釋分析圖

由表1可知，臍橙白酒中檢測(cè)出10種酯類，6種醇類，2種醛類，3種萜烯類和對(duì)傘花烴，共22種香氣成分。萜烯類占比最大，為50.00%，酯類物質(zhì)占香氣成分檢出物的34.57%，醇類物質(zhì)占15.14%，醛類物質(zhì)占0.28%，對(duì)傘花烴占0.01%。在所有酯類成分中，癸酸乙酯的含量最高為1673.78 μg/L±292.96 μg/L，其次月硅酸乙酯的含量為600.24 μg/L±193.77 μg/L，十六烷酸乙酯的含量為124.57 μg/L±44.24 μg/L。另外，臍橙白酒的醇類香氣成分中，戊醇、辛醇和2-苯乙醇三者的含量較高，分別為782.90 μg/L±16.27 μg/L、180.15 μg/L±41.08 μg/L、177.45 μg/L±20.10 μg/L。萜烯類中具有油香味的巴倫西亞橘烯的含量是所有成分中含量最高的物質(zhì)，達(dá)到 3700.30 μg/L±148.45 μg/L。稀釋分析結(jié)果（圖2）表明，臍橙白酒中的關(guān)鍵香氣成分共4種：其中2-苯乙基乙酸酯和2-苯乙醇的稀釋因子均為4，丁酸乙酯的為8，己硫醇的稀釋因子最大為16，即具有堅(jiān)果香味的己硫醇是臍橙白酒的最關(guān)鍵的香氣成分。

2.3 臍橙果酒和臍橙白酒香氣成分分析結(jié)果對(duì)比

在臍橙果酒和臍橙白酒中共檢測(cè)出7種酯類，5種醇類和2種醛類共14種共同的香氣成分，主要表現(xiàn)為菠蘿、蘋果、香蕉等果香味，玫瑰等花香味，醋酸味，溶劑味、堅(jiān)果味，焦糊味和汗臭味。其中具有堅(jiān)果味的己硫醇在臍橙果酒和臍橙白酒中稀釋因子均最高，其對(duì)臍橙果酒和臍橙白酒的香氣組成影響均較大，是關(guān)鍵香氣成分。

2.3.1 酯類香氣成分的比較

酯類物質(zhì)是由醇和酸經(jīng)過(guò)酯化作用而產(chǎn)生的，酯類物質(zhì)所具有的獨(dú)特的果香、花香使得其在各種酒品的香氣組成中占有重要地位[18-19]。在臍橙果酒和臍橙白酒中均檢測(cè)出了乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、月桂酸乙酯等7種酯類物質(zhì)，而這7種酯類在臍橙果酒中占總香氣成分的15.76%，在臍橙白酒中占總香氣成分的36.34%，其中，各種酯類在臍橙果酒和臍橙白酒中含量的差異也較大，如乙酸乙酯在臍橙果酒中的濃度為212.13 μg/L±67.55 μg/L，在臍橙白酒中降低到了40.83 μg/L±7.46 μg/L，而在臍橙果酒中濃度相對(duì)較低的月桂酸乙酯在臍橙白酒中的濃度達(dá)到了600.24 μg/L±193.77 μg/L。除了共有的酯類物質(zhì)，二者還具有各自的特色香味。如臍橙果酒中檢測(cè)出的甲基丁酸乙酯具有蘋果味，琥珀酸二乙酯具有獨(dú)特成熟的果香味，在臍橙白酒中卻并未檢測(cè)到。而具有果香味的己酸乙酯和蠟味的十六烷酸乙酯僅在臍橙白酒中被檢測(cè)到。綜上，所含酯類含量的差異和種類的不同使臍橙果酒和臍橙白酒的香氣組成存在較大差異。

2.3.2 醇類香氣成分的比較

醇類物質(zhì)通常來(lái)源于酵母的糖代謝和氨基酸代謝過(guò)程[20]，此外，還有部分經(jīng)莽草酸在酵母體內(nèi)代謝合成，因此醇類物質(zhì)的風(fēng)味主要集中在酵母發(fā)酵的發(fā)酵香味[21]，如辛醇和糠醇的焦糊香味（類似于發(fā)酵面包的焙烤香味），2-苯乙醇清甜的玫瑰花香，α-萜品醇的薄荷清新，己硫醇的堅(jiān)果香，芳樟醇的花香，以及反式香芹醇的溶劑味等。以上各種代表性的醇類香氣，大大增加了酒品的風(fēng)味特色。其中2-苯乙醇是苯丙氨酸經(jīng)上述氨基酸代謝過(guò)程而形成的[22]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的臍橙果酒和臍橙白酒共同含有戊醇、己硫醇、辛醇、反式香芹醇、2-苯乙醇等5種醇類，其在兩者的香氣成分中的含量存在較大差異（表1）。如具焦糊味的辛醇和玫瑰花味的2-苯乙醇在臍橙果酒中的含量分別為763.21 μg/L±176.88 μg/L和313.06 μg/L±89.09 μg/L，在臍橙白酒中分別降低至180.15μg/L±41.08μg/L和177.45μg/L±20.10 μg/L。而戊醇、己硫醇等在兩種酒品中的含量差異極小。此外，僅在臍橙果酒中檢測(cè)出的具有中藥味的丁醇，花香味的芳樟醇，油香味的1-萜品烯-4-醇，焦糊味的糠醇以及薄荷味的α-萜品醇。醇類香氣組成的復(fù)雜性使臍橙果酒的風(fēng)味較臍橙白酒更為多元化。

2.3.3 有機(jī)酸類等其他香氣成分的比較

在本研究中，有機(jī)酸類香氣成分在臍橙白酒中未被檢測(cè)到，而在臍橙果酒中僅有醋酸和辛酸兩種有機(jī)酸被檢測(cè)到。醋酸的典型風(fēng)味是酸味，辛酸具有輕微的汗臭味。酵母代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸，但卻極易與果酒中的醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成羧酸酯[23-24]。因此，在臍橙果酒中檢測(cè)到的有機(jī)酸含量較低，且在臍橙白酒中并未檢測(cè)到。此外，僅在臍橙白酒中檢測(cè)到具有柑橘香味的D-檸檬烯，刺激性氣味的對(duì)傘花烴，青草味的β-芹子烯和油香味的巴倫西亞橘烯，其中巴倫西亞橘烯的含量較高，為3700.30 μg/L±148.45 μg/L，D-檸檬烯的含量為360.45±3.42 μg/L，β-芹子烯的含量為59.18 μg/L±13.52 μg/L，相比之下，對(duì)傘花烴的含量較低，僅為1.05 μg/L±0.43 μg/L?？偟膩?lái)看，盡管這些物質(zhì)含量較高，但由稀釋分析結(jié)果可知，有機(jī)酸等其他香氣成分的稀釋因子均小于2（圖1和圖2）。因此，有機(jī)酸不是臍橙果酒和臍橙白酒中的關(guān)鍵香氣成分。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取法對(duì)待測(cè)的臍橙果酒和臍橙白酒樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合稀釋分析，經(jīng)GC-O-MS技術(shù)分析，由質(zhì)譜數(shù)據(jù)、嗅聞結(jié)果和計(jì)算出的保留指數(shù)，從臍橙果酒和臍橙白酒里共鑒定出33種香氣化合物，包括12種醇類、12種酯類、3種醛類、2種酸類、3種烯萜類和對(duì)傘花烴。其中丁酸乙酯、甲基丁酸乙酯、丙醇、己硫醇、芳樟醇、2-苯乙醇、反式香芹醇、2-苯乙基乙酸酯、戊醇等對(duì)臍橙果酒香氣的貢獻(xiàn)較大，前6種的稀釋因子都在8或者8以上。而對(duì)臍橙白酒香氣貢獻(xiàn)較大的化合物相對(duì)較少，主要有丁酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、己硫醇、2-苯乙醇?？偟膩?lái)看，己硫醇在臍橙果酒中的稀釋因子達(dá)到2048，在臍橙白酒中達(dá)到16，是這兩種酒品中最關(guān)鍵的香氣成分。正是這些香氣成分在臍橙果酒和臍橙白酒中含量及種類的不同，構(gòu)成了臍橙果酒和臍橙白酒獨(dú)特的風(fēng)味。本研究可為提高臍橙果酒和臍橙白酒的品質(zhì)提供參考，推動(dòng)臍橙深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。