于錦慧 孫穎 蘇在明 李智文 張樂 張亞黎 劉菊芬 王琳琳 任愛國(guó) 靳蕾

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期暴露于含鎘(Cd)環(huán)境可能增加胎兒神經(jīng)管缺陷(Neural Tube Defects，NTDs)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]，因NTDs流產(chǎn)的孕中期婦女全血中Pb的水平明顯高于對(duì)照組[2]，暴露于As環(huán)境胎兒NTDs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)上升[3-4]。母親攝入過(guò)量Mo不利于胚胎發(fā)育[5]，母親頭發(fā)中Ni和Mo含量與NTDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[6]。出生缺陷發(fā)生率的空間分布與土壤中Zn、Se元素含量分布呈一定程度負(fù)相關(guān)關(guān)系[7]，但目前有關(guān)元素暴露與NTDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系并無(wú)定論。

以往研究采用母血、胎盤、頭發(fā)等標(biāo)本中元素含量來(lái)間接評(píng)估胎兒宮內(nèi)暴露情況[2, 6, 8]。臍帶是從卵黃囊和尿囊分化而來(lái)，是胎兒身體的一部分，能直接反映胎兒宮內(nèi)暴露的情況[9]。在胎兒臍帶組織元素暴露水平與NTDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的病例對(duì)照研究中，病例多數(shù)為產(chǎn)前診斷引產(chǎn)的患兒，對(duì)照多為足月的健康新生兒，病例組與對(duì)照組的孕齡差異很大。如果不清楚孕齡與臍帶元素含量的關(guān)系就無(wú)法得到可靠的研究結(jié)論。查閱相關(guān)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)人類胎齡與臍帶組織元素水平關(guān)系的研究，本研究利用不同胎齡神經(jīng)管缺陷兒臍帶組織元素暴露水平探究胎齡與臍帶組織元素水平的關(guān)系，為后續(xù)分析奠定基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

研究對(duì)象來(lái)自山西省太谷縣、平定縣、昔陽(yáng)縣、壽陽(yáng)縣、澤州縣、太原市和長(zhǎng)治市2004年至2016年間，由產(chǎn)前超聲確診后引產(chǎn)或出生時(shí)發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)管缺陷兒，共166名，均為單胎，胎齡16～44周，中位值28.4周，胎齡四分位間距(23，34)周。研究方案通過(guò)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)，募集時(shí)母親簽署了知情同意書。

二、方法

1.問卷調(diào)查：確診病例后由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員對(duì)孕婦進(jìn)行面對(duì)面訪談?wù){(diào)查，內(nèi)容包括分娩年齡、孕前體重指數(shù)(BMI)、職業(yè)、文化程度、孕次、畸形兒生育史、孕期高熱或感冒病史、主動(dòng)或被動(dòng)吸煙情況、是否飲白酒等信息。

2.標(biāo)本采集與元素分析：胎兒娩出后，采集5～10 cm臍帶組織存放在-20 ℃冰箱中備用。在冷凍狀態(tài)下分離2 g左右的臍帶，用干凈剪刀將臍帶血管剪開，用超純水沖凈其中的血凝塊，放入干凈聚乙烯自封袋中存放在-20℃冰箱中備用。將于-80 ℃冰箱里預(yù)冷至少24 h以上的臍帶樣品，置于預(yù)熱1 h的CHRIST真空冷凍干燥機(jī)中凍干。稱量?jī)龈珊髽悠?，并比較凍干前后樣品重量，計(jì)算臍帶組織含水率(臍帶組織平均含水率約為90%)。

準(zhǔn)確稱取0.2 g左右(d=0.001 mg，SARTORIUS公司，CP225D型)凍干臍帶組織放入石英消解管中，加入3.0 ml硝酸溶液(UP級(jí)，蘇州品瑞化學(xué)有限公司)，放置1 h。加入0.5 ml雙氧水(UP級(jí)，蘇州品瑞化學(xué)有限公司)，并用超純水(電阻率≥18.2兆歐)定容至15 ml，加蓋。放入U(xiǎn)ltra WAVE(意大利Milestone公司)微波消解儀中，加壓40 bar，處理1 h。同步制備空白樣。用超純水將消化液稀釋2倍后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，美國(guó)Agilent公司，7700x型)檢測(cè)。每批次同步處理并檢測(cè)2份標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) [ 豬肝(GBW 10051)] 作為質(zhì)控。

3.儀器檢出限：硒(Se)為0.06 ng/ml，鈷(Co)為0.0019 ng/ml，鎘(Cd)為0.006 ng/ml，砷(As)為0.016 ng/ml，鉛(Pb)為0.0172 ng/ml，鎳(Ni)為0.0225 ng/ml，鉬(Mo)為0.0283 ng/ml，鋅(Zn)為0.4044 ng/ml，錳(Mn)為0.0235 ng/ml。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：元素含量采用中位值及四分位間距 [ M(P25，P75)] 表示，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較不同胎齡組元素含量。對(duì)于不同胎齡組含量有差異的Zn、Mn、Mo、Ni四種元素，將各元素含量均四等分，由小到大分別賦值為1、2、3、4，分別采用有序多分類Logistic回歸模型調(diào)整潛在混雜因素后，分析胎齡與元素含量的關(guān)系?；祀s因素包括母親年齡、文化程度、職業(yè)、孕前BMI、孕次、孕早期高熱或感冒史、出生缺陷生育史、主動(dòng)或被動(dòng)吸煙和飲白酒情況。應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05(雙側(cè))。

結(jié) 果

一、胎兒及其母親的主要特征

胎兒及其母親的主要特征見表1。母親年齡的中位值為26歲，四分位間距(23，31)歲。77.7%的母親為農(nóng)民，83.4%的母親文化程度為初中或更低。孕前超重或肥胖人數(shù)占53.4%。胎兒胎齡中位值28.4周，四分位間距(23, 34)周。

表1 胎兒及其母親的主要特征

a:There is missing data for the variable.

二、不同胎齡兒臍帶組織中九種元素含量比較

在五個(gè)胎齡組中，臍帶組織中Ni、Mo、Zn、Mn含量的中位值及四分位間距分別為28.99 (20.10，49.76) ng/g、26.52 (21.75，33.11) ng/g、52.69 (44.79，61.78) μg/g、0.42 (0.33，0.55) μg/g，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Ni在38≤胎齡<45周組的中位值比其他四個(gè)胎齡組均低(調(diào)整P值后，P<0.05)；Mo在38≤胎齡<45周組的中位值比16≤胎齡<23周的中位值均高(調(diào)整P值后，P<0.05)；調(diào)整P值后，Zn濃度在不同胎齡組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Mn在16≤胎齡<23周組的中位值比23≤胎齡<28周、28≤胎齡<33周、33≤胎齡<38周的中位值高(調(diào)整P值后，P<0.05)。臍帶組織中Se、Co、Cd、As、Pb含量的中位值及四分位間距分別為0.56 (0.50，0.64) μg/g、3.47 (2.48，5.14) ng/g、1.33 (0.57，3.51) ng/g、6.33(3.96，9.47)ng/g和27.32(18.37，50.34)ng/g，不同胎齡組間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

三、胎齡與臍帶組織中Ni、Mo、Zn和Mn元素含量的關(guān)系

采用有序多分類Logistic回歸模型調(diào)整混雜因素后，以16≤胎齡<23周組為參照，Ni在38≤胎齡<45周組含量較其他胎齡組低，Mo在28≤胎齡<33周和38≤胎齡<45周組含量較其他胎齡組高，Zn在23≤胎齡<28周和33≤胎齡<38周含量較其他胎齡組低，Mn在23≤胎齡<28周、28≤胎齡<33周、33≤胎齡<38周組含量較其他胎齡組低。見表3。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)以16≤胎齡<23周為參照，Ni在38≤胎齡<45周含量降低，Mo在28≤胎齡<33周和38≤胎齡<45周含量升高，Zn在23≤胎齡<28周和33≤胎齡<38周含量降低，Mn在23≤胎齡<28周、28≤胎齡<33周、33≤胎齡<38周含量降低。未發(fā)現(xiàn)臍帶組織中Se、Co、Cd、As、Pb元素含量與胎齡相關(guān)。

有關(guān)臍帶組織中元素含量的研究較少。本研究檢索了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，僅找到兩篇有關(guān)足月新生兒臍帶組織中元素含量的研究(見表4)。兩個(gè)研究均采用與本研究相同的ICP-MS檢測(cè)方法。日本的研究檢測(cè)的是48名健康足月兒(37～41周)的凍干臍帶Se、Cd、Pb、Zn元素含量[10]，結(jié)果與本研究接近。另外一個(gè)是英國(guó)的父母和兒童隊(duì)列研究(The Avon Longitudinal Study of Parents and Children, ALSPAC)[11]，該研究測(cè)定的是濕重臍帶組織中的Se、Pb、Zn元素含量，報(bào)告的是幾何均數(shù)。本研究中Se、 Pb、Zn含量幾何均數(shù)分別為551.87 ng/g、28.59 ng/g、56 697.26 ng/g，與英國(guó)的研究差異懸殊，即使考慮了臍帶組織的含水率后(約為90%)，本研究的結(jié)果仍明顯高于該研究。

表2 不同胎齡的臍帶組織中九種元素含量

Kruskal-Wallis test,*P<0.05

表3 臍帶組織Ni、Mo、Zn和Mn元素含量與胎齡的關(guān)系

*P<0.05

表4 三項(xiàng)研究中臍帶組織元素值對(duì)比

a:The concentration is shown as median and interquartile range, DW:dry weight; b:The concentration is shown as geometric mean, WW:wet weight.

檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，未見有關(guān)臍帶組織元素含量與胎齡關(guān)系的研究，因此，本研究通過(guò)有關(guān)孕周和母親血液或頭發(fā)中元素含量關(guān)系的研究結(jié)果，探索其規(guī)律的一致性。母親孕早期血清Zn含量較孕晚期高[12-13]，如在西班牙亞拉貢地區(qū)的研究檢測(cè)了159名健康妊娠婦女血清中Zn元素濃度，發(fā)現(xiàn)血清Zn含量中位值在孕5～15周時(shí)為72.0 μg/dl， 在孕15～25周、25～35周、35～40周中位值都是60.0 μg/dl，即Zn含量在5～15周時(shí)較高[12]，這與本研究臍帶組織中的Zn含量變化規(guī)律不同。上海市郊區(qū)婦女孕晚期(28周至分娩前)頭發(fā)中Ni含量下降(P<0.05)[14]，與本研究中Ni元素濃度在38～44周組含量降低的結(jié)果一致。且上海市郊區(qū)婦女孕晚期(28周至分娩前)頭發(fā)中Co含量也無(wú)孕周差異[14]。本研究中Mn和Zn元素濃度在16～22周和33～37周組低于38～44周，而上海市郊區(qū)婦女孕晚期(28周至分娩前)頭發(fā)中Mn含量下降(P<0.05)，而Zn含量在孕晚期至分娩前無(wú)差異[14]。

鑒于缺乏母親頭發(fā)、血液、胎盤、臍帶血或臍帶組織相關(guān)元素含量之間的關(guān)系或上述元素與孕周關(guān)系研究的文獻(xiàn)，尚難以通過(guò)其他研究的結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)本研究的發(fā)現(xiàn)，提示將來(lái)需要重視這方面的研究。

本研究首次采用臍帶組織樣本中元素含量作為胎兒體內(nèi)元素水平標(biāo)志物來(lái)研究胎齡與胎兒體內(nèi)元素水平的關(guān)系，然而由于臍帶樣品來(lái)自NTDs患兒，可能與健康胎兒存在一定差異，但由于未足月健康胎兒的臍帶組織難以獲得，通過(guò)NTDs病例的臍帶組織觀察也不失為一種權(quán)宜之計(jì)。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)166例16～44周NTDs胎兒臍帶組織分析胎齡與臍帶組織九種微量元素含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)臍帶組織中Zn、Mn、Mo、Ni含量與胎齡有關(guān)，而Se、Co、Cd、As和Pb元素含量與胎齡無(wú)關(guān)。