曾濤，羅沈斌，索化夷，2＊

（1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

豆豉屬于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。豆豉能產(chǎn)生多種功能活性物質(zhì)［1－4］，具有降血壓［5－7］、抗氧化［8－11］、抗腫瘤等功效［12，13］。重慶永川豆豉屬于毛霉型豆豉，采用開放式制曲，發(fā)酵過程有多種微生物的參與。真菌（細(xì)菌）菌落的構(gòu)成和其動態(tài)變化是豆豉發(fā)酵正向進(jìn)行的微生物基礎(chǔ)，因此，研究豆豉發(fā)酵過程菌群動態(tài)變化是非常必要的。目前PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種豆豉菌群結(jié)構(gòu)的研究中［14－19］。Chen C等［20］采用PCR-DGGE技術(shù)對不同品牌、不同產(chǎn)地的成品豆豉的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分別以總狀毛霉、米曲霉和根霉為核心真菌的豆豉；嗜鹽四聯(lián)球菌和枯草芽孢桿菌是豆豉中的常見細(xì)菌菌株。Chen等［21］也采用PCR-DGGE技術(shù)研究了江西稻香園豆豉后發(fā)酵階段的細(xì)菌和真菌群落的動態(tài)變化。嗜熱解淀粉芽孢桿菌、乳酸乳球菌以及枯草芽孢桿菌為優(yōu)勢細(xì)菌菌株；在真菌水平上，米曲霉占絕對優(yōu)勢，并有多種酵母參與后發(fā)酵。Chen等［22］研究發(fā)現(xiàn)稻香園豆豉表面和深層發(fā)酵的豆豉的菌群結(jié)構(gòu)是不一致的。而目前關(guān)于重慶永川豆豉發(fā)酵過程中菌落動態(tài)變化的研究還比較少見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲階段的曲料：采集于永川豆豉廠，并采集添加了輔料（白酒、食鹽、醪糟）的豆豉曲料，在實驗中進(jìn)行后發(fā)酵取樣；Soil DNA Kit試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑：購于北京索萊寶生物科技有限公司；丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺：于Sigma公司；T4連接試劑盒、Top10感受態(tài)細(xì)胞以及pLB零背景快速克隆試劑盒：購于北京天根生物有限公司。

1.2 豆豉的制作［23］

永川毛霉型豆豉的工藝流程：

篩選優(yōu)質(zhì)黃豆→浸泡→瀝干水→常壓蒸料→冷卻→攤放在簸箕中自然發(fā)酵制曲→翻曲→下架→拌料（食鹽含量13～14g／100g、醪糟3g／100g、白酒3g／100g）→入罐后發(fā)酵→成品豆豉。

取樣后存放至－80℃冰箱進(jìn)行保存。樣本編號及對應(yīng)取樣時間見表1。

表1 實驗樣品及其對應(yīng)的取樣時間Table1 Experimental samples and their relative sampling time

1.3 豆豉發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的測定方法

1.3.1 不同發(fā)酵時期的豆豉樣品的總DNA提取

按照 Omega Soil DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.3.2 永川毛霉型豆豉細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的巢式PCR擴(kuò)增

以DNA為模板，用16SrRNA V3區(qū)通用引物［24－26］：338F（5′-ACT CCT CGG GAG GCA GCA G-3′）及518R（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），以25μL為體系（1μL模板；引物各1μL；12.5μL 2×Taq PCR MasterMix；9.5μL ddH2O），反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，55 ℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸5min，進(jìn)行第1次擴(kuò)增。以PCR 產(chǎn)物作為模板，用引物338F（5′-ACT CCT CGG GAG GCA GCA G-3′）和 518R（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），并在引物338F的5′末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），以50μL反應(yīng)體系（2μL模板；引物各2μL；25μL 2×Taq PCR MasterMix；19μL ddH2O），采用降落PCR反應(yīng)程序，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65～55℃退火30s（每個循環(huán)降低0.5℃），72℃延伸30s，20個循環(huán)，94℃30s，55℃30s，72 ℃ 30s，8個循環(huán)，72℃延伸7min，進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

1.3.3 永川毛霉型豆豉細(xì)菌18SrDNA的巢式PCR擴(kuò)增

以DNA 作為模板，用18SrRNA 引物［27］：NS1（F）（5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）及Fung（R）（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′），以25μL反應(yīng)體系（1μL模板；引物各1μL；12.5μL 2×Taq PCR MasterMix；9.5μL ddH2O），采用反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸5min，進(jìn)行第1次擴(kuò)增。以PCR產(chǎn)物作為模板，用引物NS1（F）（5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）及Fung（R）＋（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′），并在引物Fung（R）＋的5′末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），以50μL反應(yīng)體系（2μL模板；引物2μL；25μL 2×Taq PCR MasterMix；19μL ddH2O），采用降落PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65～55℃退火30s（每個循環(huán)降低0.5℃），72℃延伸30s，20個循環(huán)，94℃30s，55℃30s，72℃30s，8個循環(huán)，72℃延伸7min，進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

1.4 DGGE水平電泳分析

使用聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1）進(jìn)行制膠，細(xì)菌采用變性梯度為35%～65%，真菌采用變性梯度為20%～50%，進(jìn)行DGGE電泳分析。在60℃緩沖液條件下，以130V，6h進(jìn)行電泳檢測。搖床脫色45min后置于紫外光譜檢測儀下觀察DGGE電泳結(jié)果。

1.5 PCR-DGGE切膠以及擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆

切膠回收后，采用天根生化科技有限公司的pLB零背景快速克隆試劑盒說明書進(jìn)行克隆。

1.6 質(zhì)粒檢測以及數(shù)據(jù)分析

待克隆過后的固體平板長出菌落后，挑取單個菌落到加入抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后再按照北京索萊寶科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，提取后放在－20℃冰箱保存，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳檢測合格后送到生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行常規(guī)測序分析，將序列結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行處理。

2 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析結(jié)果

2.1 真菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

對各發(fā)酵階段的豆豉樣品的真菌巢式PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行DGGE電泳分析，可以切出17條明顯的條帶，分別編號為1～17，見圖1。

圖1 不同豆豉樣品中的真菌巢式PCR的DGGE電泳圖譜Fig.1 DGGE electrophoretogram grams of nested PCR of fungi in different fermented soya beans samples

各個條帶DNA樣品經(jīng)過克隆擴(kuò)增得到的質(zhì)粒序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共得到14種不同的真菌，見表2。

表2 豆豉發(fā)酵過程中真菌鑒定結(jié)果Table2 Identification results of fungi during fermentation of fermented soya beans

由圖1可知，永川豆豉制曲階段占主導(dǎo)地位的真菌是總狀毛霉，此外，米曲霉、米根霉、匍枝根霉也輔助發(fā)酵。由于輔料的添加以及入罐發(fā)酵的缺氧環(huán)境，后發(fā)酵時期優(yōu)勢真菌菌株的豐度均下降?？偁蠲?、米根霉等真菌具有產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等多種酶系的能力［28］，降解大分子的糖類和蛋白質(zhì)，促進(jìn)發(fā)酵的正向進(jìn)行，為后發(fā)酵階段的酵母和乳酸菌的生長提供了營養(yǎng)素。因此，后發(fā)酵階段有一些耐鹽的酵母參與發(fā)酵，如假絲酵母、德巴利氏酵母、釀酒酵母、魯氏接合酵母等。酵母對成品豆豉中芳香物質(zhì)的產(chǎn)生有重要影響，其生長和脂類、有機酸類形成密切相關(guān)。另外，發(fā)酵過程出現(xiàn)少量真菌類雜菌，如青霉屬和赤霉屬等。這表明永川毛霉型豆豉的開放式制曲發(fā)酵方式有雜菌引入的安全隱患。

2.2 細(xì)菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

對各發(fā)酵階段的豆豉樣品的細(xì)菌巢式PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行DGGE電泳檢測，有23條明顯條帶，編號為1～23，見圖2。

圖2 不同豆豉樣品中的細(xì)菌巢式PCR的DGGE電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoretogram of nested PCR of bacteria in different fermented soya beans samples

經(jīng)過克隆、測序、比對，共得到23株不同的細(xì)菌，具體見表3。

表3 豆豉發(fā)酵過程中細(xì)菌鑒定結(jié)果Table3 Bacterial identification results of fermented soya beans during fermentation

續(xù) 表

由圖2可知，整體上后發(fā)酵階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度更高一些。在制曲階段，生長旺盛的真菌產(chǎn)生大量酶，降解大豆中大分子的營養(yǎng)素，促進(jìn)后發(fā)酵中乳酸菌類的生長。永川毛霉型豆豉制曲階段占主導(dǎo)優(yōu)勢的細(xì)菌是乳酸乳球菌，由于輔料的添加，其在后發(fā)酵階段后期幾乎消失；后發(fā)酵階段主要由魏斯氏菌、乳桿菌屬、明串珠菌、枯草芽孢桿菌等共同參與。由于大量的乳酸菌的繁殖，產(chǎn)生的乳酸可以抑制一些雜菌的生長和真菌毒素的產(chǎn)生。另外，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，pH下降，酸化是風(fēng)味形成的重要前提條件?？莶菅挎邨U菌具有產(chǎn)生蛋白酶的能力，可以有效促進(jìn)發(fā)酵的正向進(jìn)行。另外，后發(fā)酵階段還出現(xiàn)了大豆中常見的根瘤菌和慢生根瘤菌。同樣地，豆豉在發(fā)酵過程中出現(xiàn)了費格森埃希菌、新鞘脂菌等細(xì)菌類雜菌［29］。

3 結(jié)論

永川豆豉制曲階段總狀毛霉（M.racemosus）一直占據(jù)絕對的優(yōu)勢，同時還有匍枝根霉（R.stolonifer）、米根霉（R.oryzae）、米曲霉（A.oryzae）等常見工業(yè)真菌輔助發(fā)酵。后發(fā)酵階段有假絲酵母（Candida）、釀酒酵母（S.cerevisiae）、魯 氏 接 合 酵 母 （Zygosaccharomyces rouxii）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）多種酵母參與發(fā)酵。參與后發(fā)酵的酵母種類和稻香園豆豉菌群研究結(jié)果基本一致。在細(xì)菌水平上，制曲階段乳酸乳球菌（L.lactis）占優(yōu)勢，而拌料后急劇減少，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）等耐鹽性強的菌株成為優(yōu)勢菌株。永川豆豉鮮香味美、入口即化的優(yōu)良品質(zhì)是由整個發(fā)酵期真菌菌落和細(xì)菌群落共同的協(xié)作結(jié)果。發(fā)酵過程中也出現(xiàn)了青霉（Penicillium）、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）、新鞘脂菌（Novo sphingobium）等雜菌，說明可能是原料或者環(huán)境中的雜菌被攜帶進(jìn)入發(fā)酵過程。