摘要：流式細胞術是檢測細胞增殖的一種重要手段，較以往的檢測方法，流式細胞儀的優(yōu)點在于能夠實現(xiàn)多熒光指標同時檢測，并且可以對混合樣品中的特定細胞進行增殖分析，本文就目前常用細胞增殖檢測染料的檢測原理，應用范圍及染色方法作進行闡述。

關鍵詞：細胞增殖;流式細胞;DNA染色;示蹤染料

中圖分類號：R392? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.016

文章編號：1006-1959（2019）01-0047-03

Method and Technique for Cell Proliferation by Flow Cytometry

HU Nai-Li

（Central Laboratory，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract：Flow cytometry is an important means to detect cell proliferation. Compared with previous detection methods， flow cytometry has the advantages of simultaneous detection of multiple fluorescence indicators， and can perform proliferation analysis on specific cells in mixed samples. At present， the detection principle， application range and dyeing method of cell proliferation detection dyes are commonly used.

Key words：Cell proliferation;Flow cytometry;DNA staining;Tracer dye

細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進行增殖，增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎，增殖檢測技術廣泛應用于分子生物學、遺傳學、腫瘤生物學、免疫學、藥理和藥代動力學等研究領域。流式細胞術是一門集現(xiàn)代激光技術、電子技術、生物學技術為一體的高通量細胞檢測技術。近年來，得益于激光技術的發(fā)展和熒光染料的開發(fā)，流式細胞術在已成為檢測細胞增殖的一種重要手段，能夠快速實現(xiàn)多參數(shù)多熒光指標的檢測。本文就目前流式細胞檢測增殖常用的方法與技術進行闡述。

1基于DNA含量的細胞增殖分析方法

1.1原理? 利用某些熒光染料具有與DNA發(fā)生特異性結合，且被DNA結合的熒光染料的量與DNA的含量成正比，即熒光強度與熒光直方圖的通道數(shù)成正比的原理，運用流式細胞儀檢測出處于G0/G1期，S期和G2/M期的細胞的比例。根據儀器的不同激光配置及實驗需求，有多種熒光染料可供選擇。

1.2常用檢測法? 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法：單細胞懸液經通透處理后，加入能夠與DNA結合的熒光染料，此時被染熒光物質的量與DNA含量成正比，檢測到熒光信號的強度即可代表DNA含量，處于G0/G1期的細胞DNA含量為二倍體，處于G2/M期的細胞DNA含量為四倍體，S期細胞染色體含量介于二倍或四倍之間，所檢測的樣品中，處于S和G2/M期的細胞越多，說明細胞增殖越活躍。PI可由488 nm或561 nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射光譜為610～620 nm，由于PI也與雙鏈RNA結合，所以在DNA含量檢測前應對樣本進行RNase消化處理，排除RNA對DNA熒光定量的影響。目前實驗室絕大多數(shù)流式細胞儀配備有PI的檢測通道，因此PI的應用十分廣泛[1-3]。其染色優(yōu)點為操作簡單，可通過一步染色法實現(xiàn)[4]，且CV值小，熒光穩(wěn)定，抗光漂白性良好。PI在使用過程中最大的限制就其光譜與其它染料的干擾問題，PI與常用染料藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）及PE檢測通道的染料光譜幾乎是重疊的，因此PI檢測周期的樣品中不能同時利用PE標記其他指標。若使用488 nm激光器激發(fā)PI，PI與異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）等染料也存在部分光譜重疊。

7-氨基-放線菌素D（7-Aminoactinomycin D，7-AAD）也是標記DNA的染料，主要以插入方式與DNA鏈的G-C堿基對結合，激發(fā)波長約為580 nm，最大發(fā)射波長為640 nm。利用流式細胞儀488 nm或561 nm激光器激發(fā)均可得到良好的檢測效果[5]。7-AAD屬細胞膜非通透性染料，不能通過完整的細胞膜，在進行DNA染色前需對細胞進行75%冷乙醇固定處理，由于7-AAD是與DNA特異性結合，因此在染色過程中無需對樣品進行RNase處理。7-AAD的發(fā)射波長較長，可與PE、FITC等常用流式染料同時使用較少發(fā)生光譜重疊。

DAPI和Hoechst33342是常用的DNA標記染料，可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結合，二者光譜較為接近，激發(fā)光為355 nm，最大發(fā)射光為461 nm，利用流式細胞儀的351 nm紫外激光器激發(fā)效果最佳，對于未配備紫外激光器的儀器，405 nm激光器激發(fā)也可得到良好的效果[6]。DAPI和Hoechst33342屬膜通透性染料，細胞染色DNA無需乙醇固定，活細胞即可，推薦染色工作液濃度均為5～10 mg/ml，避光孵育30 min后上機檢測。對于配備有355 nm或405 nm激光器的流式細胞儀而言，利用DAPI和Hoechst33342 染色細胞DNA是良好的選擇。首先，二者均使用紫外或紫色激光器激發(fā)，與488 nm、561 nm、633 nm檢測通道上的熒光染料不存在或較少存在光譜重疊，容易實現(xiàn)細胞的多指標同時檢測;其次，由于DAPI和Hoechst33342對細胞膜具有通透性，可以標記活細胞的DNA，因此是兩種可應用于活細胞分選的細胞周期染料。

DRAQ5是可發(fā)射遠紅外熒光的蒽醌類染料，激發(fā)光譜在很寬范圍內，流式細胞儀配備的488 nm、561 nm、633 nm激光器均可對其有效激發(fā)，但以633 nm激發(fā)效果最佳，DRAQ5具有膜通透，可對活細胞和固定的細胞進行DNA染色分析[7]，由于它主要和DNA雙鏈結合，和RNA的親和力小，因此染色過程中樣本無需RNase消化，利用633 nm激發(fā)光，670 nm發(fā)射光檢測DRAQ5標記細胞周期時，可與FITC、PE、GFP等熒光素同時標記較少發(fā)生光譜重疊。

1.3染色的結果分析? 以上所介紹的幾種染料，激發(fā)和發(fā)射光譜不同，但染色原理大致相同，都是根據染料的熒光道數(shù)與DNA含量成正比這一單一變量檢測，因此，只能根據DNA含量區(qū)分出G0/G1期，S期和G2/M期，而無法進一步區(qū)分出DNA含量相同的G0和G1期，G2和M期。由于處于不同時相的細胞對藥物或處理會有不同的反應，因此體外培養(yǎng)的細胞在進行干預前應進行同步化處理，否則會影響實驗的重復性。細胞同步化的方法包括、短時間饑餓、照射、低溫法、藥物抑制等物理或化學方法，血清饑餓法因對細胞本身的干擾小且能夠獲得大量的G0/G1期細胞因此而最為常用[8-10]。此外，在檢測樣品的過程中還應注意粘連體細胞的排除，兩個2C細胞粘連在一起，在流式細胞儀上檢測到的DNA的含量為4C，但由于兩個粘連細胞比單個細胞通過激光束的時間長，因此脈沖的寬度是大于單個細胞的，可以利用熒光通道的脈沖寬度信號W的差異進行排除。

對于分析癌變細胞或腫瘤活檢組織的DNA含量時，通常引入DNA指數(shù)（DI）的概念，即（樣品G0/G1期細胞峰的平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體細胞樣品G0/G1期細胞峰的平均熒光道數(shù)），理論上正常二倍體細胞DI=1，由于實際檢測存在變異系數(shù)，實際檢測到二倍體DI值為0.9～1.0，四倍體DI值為1.9～2.1，DI值對于臨床上腫瘤的診斷具有一定的參考價值。可以使用雞紅細胞或正常人的淋巴細胞作對照來確定二倍體細胞[11]，市面上也有商品化的小雞紅細胞核（CEN）用于調節(jié)二倍體峰的位置。DNA含量的檢測結果通常利用周期分析軟件進行S期劃定，一般2C峰和4C峰比較對稱，且變異系數(shù)CV較小結果比較準確，若CV>8，則無法正確分析出各期細胞比例，目前市面上常用的周期分析軟件有Muticycle、ModitLT和Flowjo等，同樣樣品結果利用不同軟件分析各期比例無顯著性差異[12]。

2示蹤染料標記法

2.1 BrdU和EdU摻入法? 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），是人工合成的胸腺嘧啶類似物，在DNA合成期（S期），BrdU能夠代替胸腺嘧啶而滲入正在復制的DNA分子中，用熒光標記的BrdU抗體進行染色，就可以標記出處于增殖期的細胞，同時結合7-AAD進行DNA染色，可清晰的將細胞區(qū)分出G0/G1期，S期和G2/M期[13]。BrdU/7-AAD雙參數(shù)法的優(yōu)勢在于S期的判定，實驗結果無需利用軟件分析即可區(qū)分各期細胞。在這個方案中，根據所用儀器的激光配置，可選擇BrdU與FITC或APC等不同熒光素連接的抗體，7-AAD也可被PI替代。目前BrdU有一大缺點，BrdU抗體分子較大，雙鏈DNA中的堿基對阻礙BrdU與抗體的結合，因此需將DNA雙鏈打開后，若DNA結構打開不充分，BrdU與熒光抗體結合不佳，導致檢測到的熒光信號不能真實準確的反映BrdU 的含量，為了能夠暴露BrdU的抗原表位，通常用高濃度的鹽酸，乙酸或酶解使得DNA變性，但這就破壞了DNA雙鏈結構，影響了其他染料的結合染色，導致染色彌散，準確性降低等問題。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時能夠插入正在復制的DNA分子中，EdU只有BrdU抗體大小的1/500，它與熒光素的結合一種被稱作“click”化學作用的Cu+催化的環(huán)加成作用，而非抗原抗體反應。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色比較，Edu反應非?？焖伲覠o需對DNA雙鏈變性，有效地避免了樣品損傷，檢測細胞增殖具有更高的靈敏度和更快的檢測速度，能在組織和細胞水平反映細胞增殖情況[14，15]。

2.2 CFSE標記法? 羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE）是目前應用廣泛的一種檢測細胞增殖的染料，CFSE的前體羧基熒光二乙酸鹽素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diactate succinimidyl ester，CFSE-SE）是沒有熒光的，但可自由透過細胞膜進入細胞，進入細胞后，其乙酸基團被胞內酯酶切除后，可產生具有熒光的CFSE，CFSE不可逆地細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質上并且長時間存在于細胞內。當細胞進行分裂增殖時，具有熒光的胞質蛋白平均分配到兩個第二代細胞中，這樣與第一代細胞相比，其熒光強度便會減弱至一半，再次分裂后，第三代細胞的熒光強度會比第二代再減弱一半，以此類推，細胞增殖代數(shù)越多，得到細胞的平均熒光強度相比第一代減弱更明顯，利用流式細胞儀488 nm激光激發(fā)，520 nm接收可檢測到細胞CFSE染色熒光，從而反映細胞的增殖情況。

CFSE探針多用于各種干細胞，淋巴細胞的增殖研究中[16，17]，可用于體外培養(yǎng)細胞分裂跟蹤，也可用于注入動物器官內觀測細胞體內增殖。由于CFSE對細胞是有一定毒性作用的，因此，染色濃度及時間對細胞增殖、分化存在著影響。有研究指出，CFSE對細胞進行染色時呈現(xiàn)濃度依賴型[18]，細胞的熒光隨著CFSE 染色終濃度升高而增強，但隨著染色濃度的增大，CFSE的細胞毒性也逐漸體現(xiàn)出來，在一定程度上可引起細胞的凋亡，不同種類的細胞CFSE的最佳標記濃度有所區(qū)別，最佳的染色濃度是使父代細胞熒光強度比未染色細胞高3～3.5個數(shù)量級[19]。CFSE染色的持續(xù)時間也很重要，孵育時間過長，可增加細胞毒性[20]，體外培養(yǎng)細胞孵育時間一般控制在10 min內，而后用40%體積的冷小牛血清終止標記10 min后重懸細胞。此外，培養(yǎng)體系或緩沖液中若存在游離氨基酸，會與CFSE結合而影響其染色效果，因此推薦用PBS配制工作液。對于檢測結果的分析，可利用ModitLT軟件進行增值代數(shù)的劃定或直接進行細胞平均熒光強度的比較。

3總結

細胞增殖的檢測時評估細胞功能的重要實驗，相對常用的比色法MTT，CCK-8等，流式細胞術最大的優(yōu)勢在于多色，多參數(shù)的檢測，可以實現(xiàn)增殖和其他指標的同時檢測，或混合樣品中特定細胞群體的增殖檢測。本文介紹的幾種增殖檢測試劑，染色原理不同，使用的激光檢測通道也有所差異，實驗者可根據流式細胞儀激光配置及實驗的具體方案進行選擇。隨著多色流式檢測技術的不斷發(fā)展，從同一份樣本獲取更多的生物學信息是今后的必然趨勢。

參考文獻：

[1]Zeng YT，Jiang JM，Lao HY，et al.Antitumor and apoptotic activities of the chemical constituents from the ethyl acetate extract of Artemisia indica[J].Molecular Medicine Reports，2015，11（3）：2234-2240.

[2]Dapena C，Bravo I，Cuadrado A，et al.Nuclear and Cell Morphological Changes during the Cell Cycle and Growth of the Toxic Dinoflagellate Alexandrium minutum[J].Protist，2015，66（1）：146-160.

[3]Uzlikova M，Nohynkova E.The effect of metronidazole on the cell cycle and DNA in metronidazole-susceptible and resistant Giardia cell lines[J].Molecular & Biochemical Parasitology，2014，198（2）：75-81.

[4]柏春玲，廖澤容，張巧，等.應用流式細胞術快速測定細胞周期的DNA一步法[J].昆明醫(yī)科大學學報，2017，38（2）：10-13.

[5]Carbonari M.New use for an old reagent：Cell cycle analysis of DNA content using flow cytometry in formamide treated cells[J].Cytometry，2016，89（5）：498-503.

[6]戶乃麗，徐曉雪，鄒林樾，等.利用405nm激光激發(fā)Hoechst33342染色細胞DNA的流式細胞技術[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（33）：6406-6409.

[7]Buzina AR，Pinto FE，Nieschke K，et al.Replacement of specific markers for apoptosis and necrosis by nuclear morphology for affordable cytometry[J].Journal of Immunological Methods，2015，420（3）：24-30.

[8]申雪沂，郭佳倩，牛長敏，等.Stra8過表達精原細胞的細胞周期同步化方法的建立[J].中國男科雜志，2017，31（6）：3-7.

[9]Medina-Reyes EI，Bucio-López L，F(xiàn)reyre-Fonseca V，et al.Cell cycle synchronization reveals greater G2/M-phase accumulation of lung epithelial cells exposed to titanium dioxide nanoparticles[J].Environ Sci Pollut Res，2015，22（9）：3976-3982.

[10]Tong J，Sun D，Yang C，et al.Serum starvation and thymidine double blocking achieved efficient cell cycle synchronization and altered the expression of p27， p53， bcl-2 in canine breast cancer cells[J]. Research in Veterinary Science，2016（4）：10-14.

[11]鄒林樾，徐曉雪，戶乃麗.雞紅細胞標準品在膠質瘤細胞DNA周期檢測中的意義[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2015，29（10）：152-153.

[12]Massey AJ.Multiparametric Cell Cycle Analysis Using the Operetta High-Content Imager and Harmony Software with PhenoLOGIC[J].PLOS ONE，2015，10（7）：e0134306.

[13]Zhao P，F(xiàn)u JL，Yao BY，et al.S phase cell percentage normalized BrdU incorporation rate，a new parameter for determining S arrest[J].Biomed Environ Sci，2014，27（3）：215-219.

[14]Harris L，Zalucki O，Piper M.BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations[J].Journal of Molecular Histology，2018，49（3）：229-234.

[15]Pereira PD，Serra-Caetano A，Cabrita M，et al.Quantification of cell cycle kinetics by EdU （5-ethynyl-2'-deoxyuridine）-coupled-fluorescence-intensity analysis[J].Oncotarget，2017，8（25）：40514-40532.

[16]Bocharov G，Luzyanina T，Cupovic J，et al.Asymmetry of cell division in CFSE-based lymphocyte proliferation analysis[J].Front Immunol，2013，4（9）：264.

[17]Rodríguez-Pardo VM，Vernot JP.Mesenchymal stem cells promote a primitive phenotype CD34+ c-kit in human cord blood-derived hematopoietic stem cells during ex vivo expansion[J].Cell Mol Biol Lett，2013，18（1）：11-33.

[18]杜振蘭，陳鵬，封志純.比較不同濃度CFSE熒光標記臍血細胞后存活率的實驗研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2016，10（3）：368-372.

[19]Lyons AB，Blake SJ，Doherty KV.Flow Cytometric Analysis of Cell Division by Dilution of CFSE and Related Dyes[J].Current Protocols in Cytometry，2013（9）：64.

[20]Luzyanina T，Cupovic J，Ludewig B，et al.Mathematical models for CFSE labelled lymphocyte dynamics：asymmetry and time-lag in division[J].Journal of Mathematical Biology，2014，69（6-7）：1547-1583.