吳曉蓉，熊英瓊，胡裕翔，許曉璇，程 藝，晏 立，吳雅俊，饒 杰

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南昌 3300062江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是一種以肌肉的易疲勞性和波動(dòng)性為特征的獲得性自身免疫性疾病，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與致病性乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)的產(chǎn)生有關(guān)。眼肌型MG(ocular MG，oMG)是MG的常見(jiàn)類型，這類患者僅有眼外肌受累，表現(xiàn)為上瞼下垂及復(fù)視，未經(jīng)治療干預(yù)多數(shù)oMG可進(jìn)展為全身型MG(generalized MG，gMG)[1]。迄今為止，oMG的發(fā)病機(jī)制及其進(jìn)展機(jī)制仍不明確，有研究表明Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的細(xì)胞間平衡失常可能與MG的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2- 3]。本課題組前期研究利用重組人AChR(H-AChR)亞單位免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠建立了眼肌型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性MG(ocular experimental autoimmune MG，oEAMG)模型[4- 7]，此模型在臨床、病理等方面極大程度地模擬了oMG，為oMG致病機(jī)制的研究提供了重要研究手段。本研究擬通過(guò)觀察HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)H-AChR γ亞單位免疫誘導(dǎo)構(gòu)建oEAMG模型過(guò)程中，oEAMG小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中Th1、Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步探討不同亞群Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在oEAMG致病機(jī)制中的作用。

材料和方法

主要試劑與儀器H-AChR [TE671細(xì)胞中提純，人源性細(xì)胞系表達(dá)天然含γ亞單位胚胎型AChR(α2βδγ)] 購(gòu)自美國(guó)Immune Globe Biotech公司，Mouse TNF ELISA試劑盒、Mouse IFN-γ ELISA試劑盒、Mouse IL- 2 ELISA試劑盒、Mouse IL- 6 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD680型)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory公司；實(shí)驗(yàn)小鼠周齡為7～8周，雄性，體質(zhì)量(26±2)g；所有小鼠以C57BL/10小鼠為遺傳背景，僅攜帶人HLA-DQ8分子，不表達(dá)鼠MHC Ⅱ類基因(Aβ0.DQ8)。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的要求，操作流程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作管理規(guī)范指導(dǎo)說(shuō)明進(jìn)行，并且已盡最大可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，減緩動(dòng)物痛苦。

動(dòng)物模型的建立與評(píng)估將27只HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為3組，即H-AChR γ亞單位免疫組、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)免疫組和E.Coli.提取物免疫組，每組9只。參照Wu等[4- 5]方法，于第0天分別用乳化于CFA的重組H-AChR γ(20 μg)亞單位、純CFA和E.Coli提取物在各組小鼠雙側(cè)肩下及足墊共4個(gè)位置局部皮下均勻注射50 μl/點(diǎn)(200 μl/只)免疫，于第30天、第60天在相同部位用相同劑量加強(qiáng)免疫2次。并自第2次免疫起，每周2位實(shí)驗(yàn)者采用雙盲法在同一時(shí)間參照Wu等[4- 5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠進(jìn)行1次眼部和全身臨床癥狀評(píng)估，2位觀察者的測(cè)量結(jié)果相關(guān)系數(shù)r>0.8。

血清AChR-Ab水平檢測(cè)參照Wu等[4- 5]方法，于第2次免疫后15和45 d分別自H-AChR γ亞單位免疫組、CFA免疫組和E.coli免疫組小鼠尾靜脈采血并分離血清于-20 ℃保存。采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)各組小鼠血清AChR-Ab水平，AChR-Ab的量根據(jù)125I α-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合位點(diǎn)沉淀物數(shù)量計(jì)算，所有實(shí)驗(yàn)值以實(shí)測(cè)值減去正常對(duì)照小鼠平均水平表示，單位以nmol/L表示[8]。

體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平檢測(cè)建模小鼠于第3次免疫后28 d采用頸椎脫臼迅速處死，所有處死小鼠均于75%酒精中浸泡消毒5 min，在無(wú)菌條件下分別摘取腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)以及脾臟組織，再經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)基反復(fù)清洗，200目不銹鋼網(wǎng)研碎并過(guò)濾，室溫下300×g離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清。通過(guò)加入 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，并加入臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞>95%。取48孔培養(yǎng)板，每孔4×105個(gè)淋巴細(xì)胞，每孔給予PBS，5 μg/ml的H-AChR 或2 μg/ml的H-AChR γ亞單位蛋白抗原刺激，每標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔反應(yīng)終體積為200 μl。置于培養(yǎng)箱中孵育96 h后(溫度37 ℃，5%CO2)，收集上清液，嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)上清液中γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 2、IL- 6、IL- 10的含量，于波長(zhǎng)為405 nm的酶標(biāo)儀上獲取各個(gè)樣本的OD值，再根據(jù)各細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出每個(gè)樣本細(xì)胞因子的濃度，結(jié)果以pg/ml表示[9]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

小鼠的臨床癥狀及oEAMG發(fā)病率第3次免疫后，50%以上H-AChR γ組小鼠單眼或雙眼出現(xiàn)不同程度的上瞼下垂癥狀，實(shí)驗(yàn)終止前，H-AChR γ組9只小鼠中8只(89%)有眼部癥狀，6只小鼠有完全上瞼下垂癥狀，而E.coli組和CFA組無(wú)明顯眼部表現(xiàn)，評(píng)分均為0分；H-AChR γ組眼部臨床癥狀嚴(yán)重度中位評(píng)分為1.75 (1.63，1.88)分，明顯高于E.coli組和CFA組(P均<0.001)。實(shí)驗(yàn)終止前，H-AChR γ組9只小鼠中6只(67%)小鼠有輕度的全身癥狀(1級(jí))；3只(33%)沒(méi)有明顯全身癥狀，其中2只僅有眼部癥狀為單純oMG，1只小鼠沒(méi)有全身及眼部癥狀。其他兩組沒(méi)有全身肌力減退癥狀，評(píng)分均為0分。H-AChR γ組小鼠全身臨床癥狀嚴(yán)重度中位評(píng)分為0.65 (0.55，0.80)分，明顯高于E.coli組和CFA組(P均<0.001)。溴新斯的明試驗(yàn)可完全或部分改善上瞼下垂和全身癥狀。

小鼠血清AChR-Ab水平第2次免疫后15 d，H-AChR γ組小鼠血清AChR-Ab水平為(1.48±0.83)nmol/L，明顯高于CFA組的(0.08±0.08)nmol/L和E.coli組的(0.15±0.13)nmol/L(P均<0.001)。第2次免疫后45 d，H-AChR γ組小鼠血清AChR-Ab水平為(1.55±0.99)nmol/L，也明顯高于CFA組的(0.09±0.10)nmol/L和E.coli組的(0.21±0.21)nmol/L(P均<0.001)。

各組培養(yǎng)上清液中Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較H-AChR刺激的H-AChRγ組小鼠淋巴結(jié)及脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中IL- 2(F=73.079，P<0.001；F=80.276，P<0.001)和INF-γ水平(F=32.568，P<0.001；F=30.766，P<0.001)均明顯高于E.coli組和CFA免疫組；IL- 6(F=0.983，P=0.388；F=1.809，P=0.185)和IL- 10水平(F=1.367，P=0.274；F=1.054，P=0.364)與E.coli組和CFA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。H-AChRγ刺激的H-AChRγ組小鼠淋巴結(jié)及脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中IL- 2(F=42.835，P<0.001；F=38.030，P<0.001)和INF-γ水平(F=76.332，P<0.001；F=34.865，P<0.001)均明顯高于E.coli組和CFA免疫組；IL- 6(F=1.325，P=0.284；F=1.935，P=0.166)和IL- 10水平(F=0.908，P=0.417；F=1.189，P=0.322)與E.coli組和CFA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

討 論

MG被認(rèn)為是一種經(jīng)典的由抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，而Th細(xì)胞因其能夠輔助B細(xì)胞分化成為具有抗體分泌能力的漿細(xì)胞，故在MG的致病機(jī)制中扮演重要角色[10]。Th細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子間存在著復(fù)雜而多向的信號(hào)關(guān)系，它們通過(guò)疊加、協(xié)同或者拮抗等方式發(fā)揮作用，影響著MG的發(fā)生與發(fā)展。目前普遍認(rèn)為Th1、Th2細(xì)胞之間平衡關(guān)系的破壞可能導(dǎo)致MG的發(fā)生發(fā)展，而其分泌的細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要作用[2- 3]。研究表明，Th1和Th2型細(xì)胞因子都能通過(guò)輔助B細(xì)胞誘導(dǎo)不同亞型的Ig抗體合成，但其生成的免疫球蛋白類型不同；Th1型細(xì)胞因子能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgA、IgM、IgG2a等抗體，這些類型的抗體能夠和補(bǔ)體有效結(jié)合并激活補(bǔ)體；Th2型細(xì)胞因子能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE、IgG1等類型的抗體，而這類抗體和補(bǔ)體相結(jié)合的能力很弱[11]。

表1 H-AChR刺激LN及SP體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平比較(n=9，-±s，pg/ml)Table 1 Cytokine levels in supernatant after in vitro culture of lymphocytes after stimulation of LN and SP by H-AChR (n=9，-±s，pg/ml)

H-AChR：重組人乙酰膽堿受體；LN：淋巴結(jié)；SP：脾臟；CFA：完全弗氏佐劑；IL：白細(xì)胞介素；INF-γ：γ-干擾素

H-AChR：human acetylcholine receptor；LN：lymph nodes；SP：spleen；CFA：complete Freund’s adjuvant；IL：interleukin；INF-γ：interferon-γ

表2 H-AChRγ刺激LN及SP體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平比較(n=9，-±s，pg/ml)Table 2 Cytokine levels in after in vitro culture of lymphocytes after stimulation of LN and SP by H-AChR γ(n=9，-±s，pg/ml)

H-AChRγ：重組人乙酰膽堿受體γ亞單位

H-AChRγ：human acetylcholine receptor γ subuit

Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL- 2、IFN-γ是MG和EAMG的中心效應(yīng)分子[12]。IL- 2最初被認(rèn)為是T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但近期研究表明其在體內(nèi)的主要功能是維持免疫耐受，并且對(duì)于CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能不可或缺，是自身免疫調(diào)節(jié)的重要參與者[13]。IL- 2雖然不能直接誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，但卻可以通過(guò)與復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的某些關(guān)鍵細(xì)胞因子作用而參與MG和EAMG的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[14]。MG患者血清可溶性IL- 2受體水平明顯增高，并與MG的臨床類型、病情、預(yù)后等密切相關(guān)[15]。Liu等[16]通過(guò)向EAMG小鼠體內(nèi)注射IL- 2/抗IL- 2mAb免疫復(fù)合體，能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增，從而有效抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞對(duì)AChR的反應(yīng)，減輕MG的肌無(wú)力癥狀，提示IL- 2/抗-IL- 2mAb免疫復(fù)合物在MG治療中可能具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。IFN-γ主要由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，在MG的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用[17]。Tüzün等[18]在一項(xiàng)前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)的MG患者體內(nèi)IFN-γ水平升高，且IFN-γ水平與患者治療后臨床評(píng)分之間存在直接相關(guān)性。此外，IFN-γ能夠通過(guò)上調(diào)MHC-Ⅱ類分子基因表達(dá)，活化Th1和Th2細(xì)胞，并促進(jìn)B淋巴細(xì)胞成熟而誘導(dǎo)AChR-Ab的產(chǎn)生，它還通過(guò)影響體內(nèi)外自身抗原AChR的表達(dá)，啟動(dòng)自身免疫性抗AChR反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[19]。Huang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能夠誘導(dǎo)MG患者體內(nèi)CD4(+)CD25(-)T細(xì)胞向具有免疫抑制功能的CD4(+)CD25(+)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從一個(gè)新的角度揭示了IFN-γ在MG發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL- 6、IL- 10，主要刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫應(yīng)答相關(guān)[21]。IL- 6在B細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，主要直接影響成熟的B細(xì)胞產(chǎn)生IgM、IgG、IgA，亦可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分裂。Aricha等[22]發(fā)現(xiàn)IL- 6能夠抑制Th17細(xì)胞相關(guān)基因在EAMG小鼠體內(nèi)的高表達(dá)，提示IL- 6可能在自身免疫反應(yīng)調(diào)控中起到重要作用，也從一方面說(shuō)明了IL- 6在MG發(fā)病中起促進(jìn)作用。IL- 10是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，其不僅能夠抑制Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，同時(shí)還可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和體液免疫應(yīng)答[23]。研究發(fā)現(xiàn)，MG患者血清IL- 10水平顯著升高，且經(jīng)血漿置換治療后其水平仍高于正?；€，提示IL- 10可能在MG的致病機(jī)制及病程的遷延中起到關(guān)鍵作用[24]。Sheng等[25]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中同樣證實(shí)IL- 10在EAMG小鼠的免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用，其能夠促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的增殖。Alseth等[26]分析了64例 MG患者和87例健康志愿者中IL- 10基因啟動(dòng)子區(qū)域的位置分布，發(fā)現(xiàn)IL- 10基因多態(tài)性與MG的易感性及嚴(yán)重程度存在緊密聯(lián)系。此外，有研究發(fā)現(xiàn)MG患者體內(nèi)B細(xì)胞能夠產(chǎn)生較低水平的IL- 6、IL- 10和腫瘤壞死因子-α，且這些細(xì)胞因子的水平不受免疫抑制治療的影響，提示這些B細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子可能在MG的致病機(jī)制發(fā)揮重要作用[27]。

本研究利用重組H-AChR γ亞單位免疫HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠建立oEAMG模型，并從臨床表現(xiàn)、血清AChR-Ab滴度升高等方面證實(shí)建模成功。通過(guò)ELISA檢測(cè)淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子濃度發(fā)現(xiàn)，H-AChR γ亞單位免疫組小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中Th1型細(xì)胞因子IL- 2、INF-γ水平與對(duì)照組相比顯著增高，而Th2型細(xì)胞因子IL- 6、IL- 10水平則無(wú)明顯差異。推測(cè)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在oEAMG的發(fā)病初期反應(yīng)強(qiáng)烈，同時(shí)IL- 2和INF-γ作為重要效應(yīng)因子參與oEAMG的發(fā)病過(guò)程，并可能較早參與B淋巴細(xì)胞的激活，通過(guò)細(xì)胞和抗體介導(dǎo)途徑促進(jìn)了oEAMG的啟始。Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子在oEAMG的發(fā)病機(jī)制中的作用尚不十分明確，也可能被活躍的Th1反應(yīng)系統(tǒng)所掩蓋。