■景宇超 馬豐英 楊 倩 蔣貽海*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司國家動(dòng)物用保健品工程技術(shù)研究中心，山東青島266111）

由于抗菌藥的不合理使用，加大了畜禽產(chǎn)品中藥物殘留，耐藥菌株也隨之增加?？咕幉粌H對有害菌具有滅殺作用，其對腸道內(nèi)的正常微生物群也有抑制和殺滅作用，長期使用會(huì)導(dǎo)致胃腸道正常菌群失調(diào)，引起動(dòng)物內(nèi)源性感染或二重性感染[1]。長此以往，將嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)持續(xù)發(fā)展，對人類食品安全和抗菌藥資源利用是一種巨大威脅。因此，微生態(tài)制劑應(yīng)運(yùn)而生，微生態(tài)制劑是指利用活的腸道益生菌或其菌體成分及代謝產(chǎn)物或能促進(jìn)腸道微生物生長繁殖的物質(zhì)制成的制劑[2]。能夠調(diào)節(jié)和維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌的生長、提高機(jī)體代謝以及飼料吸收率，有助于畜禽生長，而且無毒、無耐藥性，是抗菌藥的理想替代品[3-4]。

乳酸菌是一種應(yīng)用已久的益生菌，種類有200多種，其中一些乳酸菌也是腸道微生物的固有益生菌群[5-6]，乳酸菌具有多種生物學(xué)作用，包括促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)抵抗力，抑制外源有害菌等[7]。屎腸球菌屬于乳酸菌，是腸球菌屬，革蘭陽性菌[8]，需氧或兼性厭氧；是動(dòng)物腸道正常菌種之一，在腸道微生物群中維持一定比例，與其他腸道益生菌相互協(xié)作共同維持宿主的正常生理功能[9]。屎腸球菌是我國農(nóng)業(yè)部公布的飼料添加劑目錄中允許使用的微生物菌種。據(jù)報(bào)道益生腸球菌在體內(nèi)發(fā)酵可產(chǎn)生大量乙酸和乳酸，使腸道內(nèi)容物的pH值下降，從而拮抗病源性細(xì)菌的生長繁殖；同時(shí)可以產(chǎn)生細(xì)菌素，對食物中的腐敗微生物或有害病原菌起到殺滅作用。因此，屎腸球菌在微生態(tài)制劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

目前對乳酸菌屬的菌種均采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)[11]，為實(shí)現(xiàn)屎腸球菌的工業(yè)化生產(chǎn)，提高其發(fā)酵活菌量，本文對屎腸球菌CCTCCM2017191在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化，利用單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)以及中心復(fù)合序貫試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法成功優(yōu)化了屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，實(shí)現(xiàn)了屎腸球菌CCTCCM2017191的高密度發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

青島蔚藍(lán)生物股份有限公司國家動(dòng)物用保健品工程技術(shù)研究中心分離得到的屎腸球菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號為CCTCC NO:M2017191。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）；牛肉浸粉、瓊脂糖（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；K2HPO4·3H2O、檸檬酸氫二銨、硝酸鈉、硫酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；麥芽糊精、魚蛋白胨、低聚異麥芽糖、玉米漿干粉（上海瑞永生物科技有限公司）；結(jié)晶乙酸鈉、MgSO4、MnSO4·H2O、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉（天津市巴斯夫化工有限公司）；吐溫-80（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；氯化鈉、氯化氫、氫氧化鈉（天津市北辰方正試劑廠）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、恒溫?fù)u床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）、WGZ-2XJ細(xì)菌濁度計(jì)（上海昕瑞儀器儀表有限公司）、pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.1.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g/l、結(jié)晶乙酸鈉5.0 g/l、MgSO40.2 g/l、MnSO4·H2O 0.04 g/l、檸檬酸二胺 2.0 g/l、葡萄糖20.0 g/l、酵母浸粉4.0 g/l、牛肉浸粉8.0 g/l、胰蛋白胨10.0 g/l、吐溫-80 1.0 g/l，121 ℃滅菌15 min。MRS固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂糖14 g/l，121℃滅菌15 min，冷卻至不燙手即可傾倒平皿。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 屎腸球菌菌種活化

將屎腸球菌的保藏菌液于MRS平板培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；挑取平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，最后再用此菌液在MRS平板培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，培養(yǎng)新的單菌落待用。

1.2.2 屎腸球菌生長曲線的測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h，然后將其以1%(v/v)的接種量接種到三瓶盛有150 ml MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶（30%裝液量），于恒溫?fù)u床37℃、120 r/min培養(yǎng)，每間隔1 h用濁度儀測定錐形瓶中菌液濁度。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 屎腸球菌最適生長pH值的測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床37℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，然后將其以1%(v/v)的接種量接種到30%裝液量的不同pH值（pH值=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的MRS培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)，12 h后測定不同pH值培養(yǎng)基條件下菌液濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.2 屎腸球菌的最適生長溫度測定

挑取屎腸球菌的單菌落接種于盛有100 ml液體MRS培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床37℃、120 r/min培養(yǎng)12 h。將配置的MRS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到最適pH值，然后將屎腸球菌以1%(v/v)的接種量接種到30%裝液量最適pH值的MRS培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度（T=33、35、36、37、38、39、41 ℃）的恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同溫度下培養(yǎng)基中屎腸球菌的濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.3 最適碳源選擇

使用不同碳源代替MRS培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以篩選最適合該屎腸球菌生長的碳源。所選碳源包括：果糖20 g/l、蔗糖19.5 g/l、乳糖19.5 g/l、麥芽糖19.5 g/l、低聚異麥芽糖20 g/l、麥芽糊精20 g/l、可溶性淀粉20 g/l，不同碳源的添加量是按照與MRS培養(yǎng)基中葡萄糖的含碳量一致的原則換算添加，另設(shè)MRS培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至最適pH值，于最適溫度下120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同碳源培養(yǎng)基中屎腸球菌的菌液濁度以及活菌數(shù)。

1.2.3.4 最適氮源選擇

將MRS培養(yǎng)基中的碳源換為最適碳源，使用不同氮源代替MRS中的復(fù)合氮源（蛋白胨10 g/l、牛肉浸粉8 g/l、酵母粉4 g/l）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以篩選最適合該屎腸球菌生長的氮源。篩選的氮源包括：蛋白胨19.18 g/l、牛肉浸粉 21.58 g/l、玉米漿干粉 57.5 g/l、魚蛋白胨18.5 g/l、酵母浸粉37.0 g/l、硝酸鈉15.69 g/l、硫酸銨12.21 g/l，各氮源的添加量是按照MRS培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的含碳量添加的，另設(shè)復(fù)合氮源作為對照組。培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至最適pH值，于最適溫度下120 r/min培養(yǎng)12 h，然后測定不同氮源培養(yǎng)基對屎腸球菌的菌液濁度和活菌數(shù)的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出該屎腸球菌的最適碳源和氮源后，選取最佳碳源、最佳氮源、檸檬酸氫二銨、結(jié)晶乙酸鈉、檸檬酸氫二鉀、無水硫酸鎂、吐溫-80和硫酸錳共8個(gè)因子進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，以篩選影響屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的顯著影響因子。

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，選取具有顯著影響效應(yīng)的因子，根據(jù)顯著影響因子的估計(jì)系數(shù)、正負(fù)效應(yīng)，以及實(shí)際情況設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)的方向和步長，設(shè)置不同梯度進(jìn)行試驗(yàn)，以確定顯著影響因子具有最大活菌數(shù)的濃度范圍。

1.2.6 中心復(fù)合序貫設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析

以Plackett-Burman試驗(yàn)所篩選的顯著影響因子濃度作為自變量，菌液活菌數(shù)為響應(yīng)值，最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中具有最大活菌數(shù)的濃度梯度作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，采用中心序貫設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面分析法得到各顯著影響因子的最佳濃度。

1.2.7 優(yōu)化配方檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的實(shí)際效果，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，以驗(yàn)證回歸模型是否可靠，屎腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是否成功。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，利用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)，P＜0.05和P＜0.01認(rèn)為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。Plackett-Burman試驗(yàn)、中心復(fù)合序貫試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、模型建立以及響應(yīng)面分析均采用Minitab 16軟件完成。試驗(yàn)作圖采用Origin 9.0完成。

2 結(jié)果

2.1 屎腸球菌的生長曲線

根據(jù)所測菌液濁度繪制屎腸球菌CCTCCM2017191的生長曲線（見圖1）?？梢钥闯?～4 h屎腸球菌的菌液濃度沒有很大的改變，這是其進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)準(zhǔn)備階段，是屎腸球菌的遲緩期；4～12 h屎腸球菌的菌液濃度快速上升至頂峰，表明這是屎腸球菌生長繁殖最快的一個(gè)時(shí)期，此期為其對數(shù)生長期；12 h之后屎腸球菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期，菌液濃度比較穩(wěn)定，沒有很大的變化。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最適生長pH值的測定

根據(jù)屎腸球菌在不同pH值培養(yǎng)基中的生長狀況（見圖2）可知，培養(yǎng)基的pH值為8.0時(shí)屎腸球菌CCTCCM2017191具有最高的菌液濁度（P＜0.01），菌液活菌數(shù)也達(dá)到最高水平（P＜0.01），因此，確定該屎腸球菌生長的最適pH值為8.0。

圖1 屎腸球菌的生長曲線

圖2 pH值對屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響

2.2.2 最適生長溫度的測定

圖3 溫度對屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響

由圖3所示，屎腸球菌在37℃的條件下培養(yǎng)具有最高的菌液濁度（P＜0.01），并且活菌量（P＜0.01）可達(dá)最高，因此，確定該屎腸球菌的最適生長溫度為37℃。

2.2.3 最適碳源的選擇

屎腸球菌在不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后測定菌液濁度以及活菌量，由圖4可知，麥芽糊精對屎腸球菌CCTCCM2017191具有最好的培養(yǎng)效果，菌液濁度（P＜0.05）和活菌量（P＜0.01）都達(dá)到最高，因此，確定該屎腸球菌最適生長碳源為麥芽糊精。

圖4 最佳碳源篩選

2.2.4 最適氮源的選擇

不同氮源培養(yǎng)條件下屎腸球菌發(fā)酵量的差異比較大，由圖5所示，無機(jī)氮源的活菌量最低，有機(jī)氮源中酵母浸粉的菌液濁度(P＜0.05)顯著高于其他氮源，并且活菌量（P＜0.01）極顯著高于其他氮源，因此，確定該屎腸球菌的最適生長氮源為酵母浸粉。

圖5 最佳氮源篩選

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，將篩選到的最佳碳源麥芽糊精和最佳氮源酵母浸粉代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖和復(fù)合氮源作為優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，并將麥芽糊精、酵母浸粉、結(jié)晶乙酸鈉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80共8個(gè)因子作為Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本因素，另設(shè)3個(gè)虛擬變量以估計(jì)試驗(yàn)誤差，各因子取高低兩個(gè)水平（見表1）進(jìn)行試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果（見表2）。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得各因子的效應(yīng)及其顯著性（見表3），可知正效應(yīng)因子酵母浸粉（P＜0.01）和結(jié)晶乙酸鈉（P＜0.05），負(fù)效應(yīng)因子吐溫-80（P＜0.05）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，具有顯著影響效應(yīng)，其余因子（P＞0.05）差異不顯著，因此將這三個(gè)因子作為中心復(fù)合序貫試驗(yàn)的基本因素。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選結(jié)果，選取酵母浸粉、結(jié)晶乙酸鈉、吐溫-80為三個(gè)顯著因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)以獲取其在活菌數(shù)最高時(shí)的濃度區(qū)域。根據(jù)各因子的系數(shù)以及實(shí)際應(yīng)用情況確定步長并設(shè)置七個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，由試驗(yàn)結(jié)果(見表4)可知，試驗(yàn)4所對應(yīng)梯度的活菌數(shù)最高，所以選取酵母浸粉65.5 g/l、結(jié)晶乙酸鈉6.75 g/l、吐溫-80 1 g/l作為中心復(fù)合序貫試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 中心復(fù)合序貫設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析

采用中心復(fù)合序貫試驗(yàn)對酵母浸粉、結(jié)晶乙酸鈉、吐溫-80的濃度配比進(jìn)行優(yōu)化，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，試驗(yàn)4（見表4）作為中心復(fù)合序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。各因子設(shè)置三個(gè)水平（見表5），共設(shè)計(jì)20組試驗(yàn)，其中14組為析因點(diǎn)試驗(yàn)，6組為中心點(diǎn)來估計(jì)試驗(yàn)誤差，進(jìn)行試驗(yàn)得到以下結(jié)果（見表6）。

表5 中心復(fù)合序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平

表6 中心復(fù)合序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析并進(jìn)行回歸擬合，得到預(yù)測活菌數(shù)的回歸擬合方程：Y=-985.596+8.423A+205.529E+127.024L-0.031A2-12.785E2-55.1L2-0.538AE-0.24AL。（Y為活菌數(shù)預(yù)測值，A、E、L分別代表酵母浸粉、結(jié)晶乙酸鈉和吐溫-80）對所得回歸方程進(jìn)行方差分析（見表7）可知：模型的回歸項(xiàng)極顯著（P＜0.001）表明本模型是有效的，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）表明本模型不存在失擬現(xiàn)象，R-Sq與R-Sq（調(diào)整）比較接近，認(rèn)為模型的擬合效果比較好；R-Sq（預(yù)測）比較接近于R-Sq值并且R-Sq（預(yù)測）值比較大，說明用此模型進(jìn)行活菌數(shù)預(yù)測的效果可信。分析各項(xiàng)效應(yīng)的顯著性可知除一次項(xiàng)吐溫-80和交互項(xiàng)乙酸鈉×吐溫-80不顯著外，其余項(xiàng)均顯著。

表7 回歸擬合方程方差分析

繪制活菌數(shù)響應(yīng)值的等值線圖和曲面圖（見圖6和圖7）可直觀地看出各因子的交互作用對發(fā)酵活菌數(shù)的影響，從圖中可看出活菌數(shù)響應(yīng)值存在最大值，使用響應(yīng)優(yōu)化器計(jì)算活菌數(shù)的最大優(yōu)化響應(yīng)值可得在酵母浸粉77.22 g/l，結(jié)晶乙酸鈉6.42 g/l，吐溫-80 0.99 g/l時(shí)預(yù)測發(fā)酵活菌數(shù)有最大響應(yīng)值為61.07×108CFU/ml。

2.6 優(yōu)化配方檢驗(yàn)

圖6 酵母浸粉和結(jié)晶乙酸鈉交互影響屎腸球菌活菌數(shù)的曲面圖和等值線圖

圖7 酵母浸粉和吐溫-80交互影響活菌數(shù)的曲面圖和等值線圖

為了檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的實(shí)際效果，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行了5次搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見圖8）可知。屎腸球菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)所達(dá)到的平均發(fā)酵活菌數(shù)分別為61.36×108CFU/ml和13.26×108CFU/ml，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值相近，證明回歸模型可靠，成功實(shí)現(xiàn)了屎腸球菌培養(yǎng)基的優(yōu)化。

3 討論

微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)以往多是采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)完成的，單因素試驗(yàn)法只是研究某一個(gè)因子對目標(biāo)值的作用效果，不能探索因子間的交互作用，多用于試驗(yàn)中對眾多因素的最初篩選。正交試驗(yàn)雖然可以得到培養(yǎng)基各組分濃度的最佳組合，但是無法找到整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)目標(biāo)響應(yīng)值的最優(yōu)方案[12]。而Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)與中心復(fù)合響應(yīng)面分析試驗(yàn)是一套成熟高效的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它能用較少的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析出達(dá)到目標(biāo)響應(yīng)值的最佳組合條件，彌補(bǔ)了正交試驗(yàn)的不足，在多種工藝優(yōu)化試驗(yàn)方面已運(yùn)用成熟，現(xiàn)在在微生物發(fā)酵[13-14]、有效成分提取等[15]方面的應(yīng)用也越來越多。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以統(tǒng)計(jì)分析出整個(gè)試驗(yàn)中各因子的顯著水平，從而確定出具有顯著影響作用的影響因子以進(jìn)行下一步試驗(yàn)[16]。最陡爬坡試驗(yàn)是一種在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上的梯度試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以逼近顯著因子最優(yōu)響應(yīng)值所在的響應(yīng)區(qū)域，并以此作為中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，然后采用響應(yīng)面分析法得到各因子的最優(yōu)組合[17]。中心復(fù)合試驗(yàn)及響應(yīng)面分析能夠?qū)⒃囼?yàn)結(jié)果與試驗(yàn)各因子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，分析各因子間的相互關(guān)系，擬合出以試驗(yàn)結(jié)果為響應(yīng)值的整體函數(shù)關(guān)系，通過響應(yīng)值的回歸模型得出各因子最優(yōu)組合。

圖8 培養(yǎng)基優(yōu)化效果驗(yàn)證

屎腸球菌是一種農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑使用的乳酸菌，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增強(qiáng)抵抗力，提高生產(chǎn)性能等作用[18]。另外屎腸球菌也能夠抑制其他有害菌的生長[19]。因此將其開發(fā)為動(dòng)物微生態(tài)制劑，應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖業(yè)，或是作為寵物腸道保健品應(yīng)用于寵物行業(yè)，都會(huì)有很高的應(yīng)用價(jià)值。而將屎腸球菌投入工業(yè)化生產(chǎn)的前提，必須提高其發(fā)酵活菌量，本研究利用單因素試驗(yàn)以及Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)與中心復(fù)合響應(yīng)面分析試驗(yàn)對屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化篩選。

研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌CCTCCM2017191的發(fā)酵培養(yǎng)基最適pH值為8.0，最適發(fā)酵溫度37℃，最佳碳源為麥芽糊精，最佳氮源為酵母浸粉。發(fā)酵活菌量的顯著影響因子是酵母浸粉、結(jié)晶乙酸鈉和吐溫-80，經(jīng)響應(yīng)面分析法獲得的優(yōu)化高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方中酵母浸粉含量為77.22 g/l、結(jié)晶乙酸鈉為6.42 g/l、吐溫-80為0.99 g/l，其余成分含量保持不變，最終可得該屎腸球菌發(fā)酵最適培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉77.22 g/l、結(jié)晶乙酸鈉6.42 g/l、吐溫-80 0.99 g/l、檸檬酸二銨2.0 g/l、磷酸氫二鉀2.0 g/l、無水硫酸鎂0.2 g/l、硫酸錳0.04 g/l、麥芽糊精20 g/l。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵菌液活菌數(shù)可達(dá)6.136×109CFU/ml，與回歸模型的活菌數(shù)預(yù)測值相符。優(yōu)化結(jié)果是相同條件下MRS培養(yǎng)基菌液活菌數(shù)的4.63倍，成功實(shí)現(xiàn)了該屎腸球菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。