■管軍軍 張?zhí)煊?陳小鴿 王志祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001；3.河南省畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南鄭州450001）

仔豬因先天免疫力缺乏，消化系統(tǒng)不健全等生理特性，市面上出現(xiàn)了很多針對仔豬的飼料，但在使用上經(jīng)常會出現(xiàn)了一些實際問題，如采食量降低、生長停滯、腹瀉增加等情況。為了解決上述問題，可將仔豬料中主要原料豆粕與玉米進行發(fā)酵，可以降解或部分降解其中抗原、蛋白、淀粉、纖維素等組分，提高了仔豬的消化吸收能力。

目前，發(fā)酵飼料研究與生產(chǎn)主要以原料發(fā)酵為主，如發(fā)酵豆粕。研究表明，固態(tài)發(fā)酵豆粕具有培養(yǎng)基含水量少，易于干燥；廢物少，環(huán)境污染小；設(shè)備簡單，操作簡便，耗能低，投資少；后處理方便；產(chǎn)物濃度高；經(jīng)濟、成本低等優(yōu)點[1]。同時能夠應(yīng)用現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵技術(shù)進行大規(guī)模生產(chǎn)。在選擇菌種方面，國內(nèi)外通常采用的菌種有：乳酸菌、酵母菌、霉菌和芽孢桿菌等[2]。乳酸菌能夠代謝生成大量乳酸，降低pH值，改善風味，能夠防止雜菌污染，提高發(fā)酵飼料的品質(zhì)[3]。酵母在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，有抗病、強化營養(yǎng)和促進生長的效果[4]。工業(yè)中通常利用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵飼料?？莶菅挎邨U菌的大分子降解率較高，且耐酸堿及高溫，可以以活菌的形式進入動物腸道，促進斷奶仔豬的腸道發(fā)育和養(yǎng)分吸收[5]。

但是，有關(guān)全價配合飼料的發(fā)酵研究鮮有報道。本課題組結(jié)合固態(tài)發(fā)酵飼料的產(chǎn)業(yè)化實際情況，在科學設(shè)計試驗方案的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料生產(chǎn)技術(shù)，本研究主要集中在發(fā)酵的前處理階段對發(fā)酵產(chǎn)品主要營養(yǎng)指標（蛋白）的影響，為固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS-GA15購自潤盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌由河南工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；上述各菌種經(jīng)過篩選馴化后，并加以輔料經(jīng)冷凍干燥制成發(fā)酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存?zhèn)溆?。仔豬配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產(chǎn)；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱，上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司；JJ-CJ-1FD超凈工作臺，吳江市凈化設(shè)備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004B電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 測試方法

1.3.1 粗蛋白的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發(fā)酵產(chǎn)品進行粗蛋白的測定，以干基表示（P）。

蛋白增加率（%）=（P發(fā)酵后-P未發(fā)酵）/P未發(fā)酵×100

1.3.2 菌體濃度的測定

將各菌種發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，將枯草芽孢桿菌與酵母置于30℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min；將乳酸菌置于30℃條件下靜置培養(yǎng)；不同培養(yǎng)時間取樣（菌懸液）。

各取1 ml菌懸液，每種菌都分別稀釋106、107、108倍，用微量移液器取50 μl，采用涂布法接種到固體培養(yǎng)基[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+2%（w/v）瓊脂糖+蒸餾水]中，30 ℃條件下培養(yǎng)36 h，菌落計數(shù)，并計算菌體濃度（CPU/ml）。

1.4 發(fā)酵試驗

取菌種發(fā)酵劑或發(fā)酵劑活化液（發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液中進行活化培養(yǎng)一定時間，詳見1.3.2節(jié)），一定比例（108CFU/100 g飼料）接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[仔豬配合飼料551H或552H∶蒸餾水=6∶4（w∶v），裝料100 g/瓶]上。攪拌均勻后，置于30℃條件下發(fā)酵48 h，取樣，50℃條件下干燥成品備用。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前處理試驗

試驗主要研究培養(yǎng)基的處理方式，分滅菌（121℃）與未滅菌，其它因素還有培養(yǎng)基的種類及菌種，各因素的水平設(shè)置如表1所示，并進行2×2×3試驗設(shè)計，每組試驗均重復(fù)3次。

表1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前處理方法試驗各因素與水平

1.5.2 菌種發(fā)酵劑前處理試驗

試驗主要研究菌種發(fā)酵劑的處理方式，分活化與未活化，其它因素還有培養(yǎng)基的種類及菌種，各因素的水平設(shè)置如表2所示，并進行2×2×3試驗設(shè)計，每組試驗均重復(fù)3次。

表2 菌種發(fā)酵劑前處理試驗各因素與水平

1.6 統(tǒng)計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結(jié)果進行多因素方差分析（ANOVA）及最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種仔豬配合飼料的組成比較

本研究中所選用的兩種仔豬配合飼料551H及552H均是在市場上銷售的商品。表3列出了兩者組成。可以看出，這兩種商品飼料，其主要營養(yǎng)組成基本相當，關(guān)鍵的區(qū)別是在含纖維素原料上；對于551H，配方中不含有麩皮，而552H則含有6%麩皮，而且551H中含有營養(yǎng)價值較高的乳清粉，以及各種營養(yǎng)氨基酸等；除此之外，二者各自添加了不同類型的生態(tài)添加劑。因此，這兩種仔豬配合飼料體現(xiàn)了市面上主流仔豬料的營養(yǎng)組成，具有較好的代表性，可以作為本研究的主要原料。另外，從配方組成上551H更有利于年齡更小的或者說是斷奶仔豬的消化吸收，而從另一個角度，可以推導出551H應(yīng)該更有利于被微生物利用。

表3 仔豬配合飼料551H及552H配方

2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前處理對發(fā)酵的影響

對于一些飼料原料如豆粕的固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵前對主要培養(yǎng)基原料的處理主要有滅菌，其目的是為了除去豆粕中攜帶的雜菌，以免對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響；但是，從工業(yè)化的角度，無疑增加了工序及相應(yīng)的成本。對此，本研究探討了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（主要組成為仔豬配合飼料）在發(fā)酵前進行滅菌處理對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白含量的影響。如圖1所示，對于不同的固態(tài)發(fā)酵基，滅菌處理對于發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白影響不一樣，而且不同的菌種也表現(xiàn)出不同的結(jié)果。通過統(tǒng)計分析可知（表4），前處理方式（滅菌或未滅菌）對于產(chǎn)品的蛋白影響顯著（P＜0.05），而菌種的影響不顯著（P＞0.05）；至于培養(yǎng)基的影響，若以蛋白含量為考察指標，則有一定的影響（0.05＜P＜0.01，接近0.05）；若以蛋白增加率為考察指標，則影響不顯著。另一方面，前處理方式的兩個水平中，未滅菌的培養(yǎng)基對于產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率明顯高于滅菌的培養(yǎng)基（P＜0.05）。

實驗的結(jié)果表明，對于固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料，在所選用的三種菌種情況下，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行滅菌處理是不利于產(chǎn)品中蛋白的提高，反而會抑制固態(tài)發(fā)酵的進行。這與一些有關(guān)飼料原料進行滅菌處理有利于固態(tài)發(fā)酵的報道[6]不一致。具體原因可歸結(jié)為：飼料原料發(fā)酵，一般組成單一，滅菌主要是消除雜菌及鈍化一些抗營養(yǎng)因子等，有利于微生物的生長；而固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料，原料的組成多樣（見表3），經(jīng)過高溫滅菌處理，其中如維生素之類的熱敏性營養(yǎng)因子很可能被破壞，甚至在高溫下不排除各組分間發(fā)生生化反應(yīng)，導致營養(yǎng)物質(zhì)流失，不利于微生物的生長。而且，仔豬配合飼料本身作為商品，符合飼料衛(wèi)生標準，本研究中所用飼料中雜菌的含量＜1 000 CPU/g，而發(fā)酵實驗的結(jié)果也說明少量雜菌存在不會影響發(fā)酵的進行。因此，對于固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前期是不需要滅菌處理的。

2.3 菌種發(fā)酵劑前處理-活化時間的確定

目前一些生產(chǎn)發(fā)酵飼料的企業(yè)或商家，為了減少微生物實驗室方面的投資，往往購買發(fā)酵劑，直接與飼料原料進行混合發(fā)酵，從而降低發(fā)酵成本，但是發(fā)酵劑在貯運等環(huán)節(jié)很容易出現(xiàn)菌活降低甚至失活，導致發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量下降、發(fā)酵不易控制等問題。因此，本研究探討了三種發(fā)酵劑接種前進行菌種活化處理。

2.3.1 枯草芽孢桿菌

兩種培養(yǎng)液中，枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的菌活均隨著活化時間的延長而增加，但是二者在菌體濃度上有所區(qū)別，551H培養(yǎng)液更有利于枯草芽孢桿菌的生長（圖2）。統(tǒng)計分析表明，活化培養(yǎng)液的組成（P=0.000 6＜0.05）及活化時間（P=0.024 5＜0.05）均對該菌種的生長有顯著的影響，而且培養(yǎng)液551H菌體濃度明顯高于552H培養(yǎng)液（P＜0.05），活化2 h時菌體濃度最低，8 h時菌體濃度最高（P＜0.05），而2 h與4 h，4 h與6 h菌體濃度差異不顯著（P＞0.05），表明2～4 h菌種生長緩慢，活化超過4 h，菌種快速生長，應(yīng)是進入對數(shù)生長期，因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑菌種活化4 h即可進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接種，有利于菌種快速生長。

圖1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前處理對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白及其增加率的變化

表4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基前處理試驗方差分析結(jié)果

圖2 不同培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌生長情況

2.3.2 酵母

酵母在兩種培養(yǎng)液中的生長趨勢基本一致，隨著活化時間的延長，菌體濃度呈先增后降的態(tài)勢，數(shù)值上并沒有表現(xiàn)出哪一種培養(yǎng)液更有利于酵母的生長（見圖3），統(tǒng)計分析結(jié)果也說明了兩種培養(yǎng)液對于酵母的生長無顯著影響（P=0.279 7＞0.05），但活化時間對其的生長有一定的影響（P=0.053 4＜0.1）。酵母活化2 h時的菌體濃度較低，與8 h基本相當（P＞0.05），而活化4 h與6 h所測得的菌體濃度最高（P＜0.05），但是二者之間并無明顯的區(qū)別（P＞0.05）。這些分析結(jié)果表明，酵母在本研究的兩種培養(yǎng)液中活化，在2～4 h內(nèi)就能進入快速生長期，再延長活化時間，反而菌體生長緩慢，甚至出現(xiàn)濃度降低不生長的情況。因此，對于酵母發(fā)酵劑的活化時間應(yīng)控制在2～4 h，此時培養(yǎng)液中酵母生長快速，接種到固態(tài)培養(yǎng)基有利于菌種的快速生長。

2.3.3 乳酸菌

乳酸菌在兩種培養(yǎng)液中生長趨勢在前6 h內(nèi)基本一致，菌體濃度均是先增后減，而活化時間到8 h，551H培養(yǎng)液出現(xiàn)菌體濃度快速上漲的態(tài)勢，而552H培養(yǎng)液與之相反（見圖4）。不過，通過統(tǒng)計分析，所研究的兩種培養(yǎng)液（P=0.271 0＞0.05）及活化時間（P=0.684 3＞0.05）均對乳酸菌的生長影響不顯著。但是，從菌體濃度數(shù)值上看，與枯草芽孢桿菌相當（見圖2），高于酵母（見圖3）。因此，乳酸菌的活化時間在4 h內(nèi)，兩種培養(yǎng)液中均能獲得較高的菌體濃度，此時接種到固態(tài)培養(yǎng)基乳酸菌能快速生長。

圖3 不同培養(yǎng)液中酵母生長情況

圖4 不同培養(yǎng)液中乳酸菌生長情況

從上述的研究中可發(fā)現(xiàn)，三種菌種在兩種培養(yǎng)液中的生長均有一個菌體濃度增長期，不同的菌種可能活化時間不一致，但這個時間基本上可在4 h內(nèi)完成，再增加活化時間，各菌種表現(xiàn)出不同的生長特性：對于枯草芽孢桿菌則出現(xiàn)快速生長，而對于其它兩種菌種則不同程度地出現(xiàn)生長緩慢甚至不生長的狀況。這應(yīng)與菌種的特性有關(guān)：枯草芽孢桿菌好氧型，隨著活化的進行，氧氣在不斷進入，導致后期生長旺盛；而另外屬兼氧或厭氧型，對于氧氣的需求不是那么迫切，因此，后期氧氣的存在或多或少起到抑制生長的作用。當然，有關(guān)此方面的微生物生長機制仍需進一步研究。

2.4 菌種發(fā)酵劑前處理對發(fā)酵的影響

通過菌種的活化研究，可以確定3種菌種活化時間應(yīng)控制在4 h內(nèi)，均具有較高的菌體濃度，但是，經(jīng)過活化后的菌種液接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵效果是否優(yōu)于未經(jīng)活化的菌種發(fā)酵劑不能確定，而且經(jīng)過菌種活化在工業(yè)上會增加生產(chǎn)工序，從而增加生產(chǎn)成本。對此，本研究設(shè)計了相關(guān)試驗。結(jié)果如圖5所示，對于兩種固態(tài)培養(yǎng)基（551H與552H），菌種活化接種發(fā)酵后均不同程度表現(xiàn)蛋白含量及其增長率較未經(jīng)活化的高。統(tǒng)計分析結(jié)果表明(見表5)，菌種的處理方式（活化與未活化）顯著影響著發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量及其增長率（P＜0.05），而且，經(jīng)過活化后所得產(chǎn)品蛋白含量及其增長明顯高于未活化后得的產(chǎn)品（P＜0.05）；而培養(yǎng)基的影響具有選擇性，對于蛋白含量，其影響顯著（P＜0.05），且551H固態(tài)發(fā)酵基所獲得產(chǎn)品具較高的蛋白含量（P＜0.05）；另一方面，對于蛋白增加率，固態(tài)培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)品無顯著影響（P＞0.05）；至于菌種，發(fā)現(xiàn)3種菌種對于發(fā)酵產(chǎn)品也無顯著影響。

研究結(jié)果表明，菌種經(jīng)過前期活化后接種到固態(tài)培養(yǎng)基，大大縮短了菌種在新環(huán)境下的適應(yīng)期，能夠快速生產(chǎn)，而且活化后的菌種液更有利于與固態(tài)培養(yǎng)基混合均勻。因此，相同的發(fā)酵時間內(nèi)，接種未經(jīng)活化的菌種發(fā)酵劑所得的產(chǎn)品在蛋白含量及其增長率明顯低于活化的菌種，提高了發(fā)酵速度。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成一定程度上影響著發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，尤其是蛋白含量，這印證了上述仔豬配合飼料551H更有利于被微生物利用的推導。

3 結(jié)論

基于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用實際，對具有市場代表性的仔豬配合飼料551H及552H固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的前處理工序進行了研究，得到如下結(jié)論：

①以仔豬配合飼料為主要組成的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵前不需要經(jīng)過滅菌處理，有利于后續(xù)固態(tài)發(fā)酵的進行，且發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量及其增長率明顯提高。

②以仔豬配合飼料為主要組成的菌種培養(yǎng)液，在4 h活化時間內(nèi)，均能讓枯草芽孢桿菌、酵母及乳酸菌的菌體濃度達到較高水平。

圖5 菌種活化對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白及其增加率的變化

表5 菌種活化試驗方差分析結(jié)果

③菌種發(fā)酵劑經(jīng)過活化后接種固態(tài)培養(yǎng)基，提高了固態(tài)發(fā)酵速度，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量及其增長率明顯提高。

④菌種的種類在上述前處理技術(shù)中對于發(fā)酵產(chǎn)品的影響不明顯，而飼料的種類對于發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量有一定的影響。

因此，該研究結(jié)果將為工業(yè)化固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的前處理工序提供實驗與理論支撐，但是實際應(yīng)用中如何優(yōu)化各種工藝參數(shù)、成本控制等問題需要進一步研究。